[发明专利]一种预防高胶原蛋白含量基质成冻的前处理方法

说明书

本发明公开了一种预防高胶原蛋白含量基质成冻的前处理方法，所述方法是对中华人民共和国国家标准GB/T 22286‑2008、GB/T 21313‑2007中的提取步骤进了改进，在前处理提取步骤时加入乙酸铵缓冲盐溶液进行提取，步骤不变，在酶解进行的同时，加入C₁₈粉、硫酸锌，混匀，滴加几滴氢氧化钠溶液再离心，离心之后取其上清液。可以将大量蛋白胶体预防成冻或者带来大量蛋白沉淀，能够有效的解决在酶解步骤中，长时间37℃的加热后胶原蛋白就会变成水溶性的明胶，将其取出放凉后会凝结为冻，很难进行下一步净化甚至是过滤试验的问题。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及在β-受体激动剂残留量的测定或检测方法中预防高胶原蛋白含量的基质成冻的前处理方法。

背景技术

GB/T22286-2008(动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法)、GB/T 21313-2007(动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法)以及农业部1025号公告-18-2008公开的所有现行动物源性食品中β-受体激动剂残留检测包括液相色谱-串联质谱法等β-受体激动剂残留量的测定方法中，针对动物源性食品含脂肪、胶原蛋白、胶原蛋白成分高的基质，在进行震荡酶解，离心步骤后，需要取上清液，在实际操作过程中会发现，上清液会成胶体状态或者是融化胶体状态，无法按照标准进行取上清液和调pH的步骤，或者在后期上净化柱时，会因为这个状态过净化柱速度减慢，甚至不滴，造成回收率偏低，检测结果不准确，甚至检测无法进行，行过滤或者净化步骤时离不开37℃水浴过程，该条件在实际操作过程中无法掌控。从另一方面来讲，含脂肪成分较高的肉类基质，都属于富含动物结蹄组织的原料，其主要成分是胶原蛋白，它们在进行震荡，37℃恒温水浴加热的过程中，在组织蛋白酶的作用下，使肌浆蛋白质一部分分解成肽而游离出来，而一些氧基酸随着水温的升高也溶于汤中，肉皮中的胶原蛋白也分解成明胶。酶解步骤在检测方法中一般要进行16h以上，在长时间的加热后胶原蛋白就会变成水溶性的明胶，将其取出放凉后会凝结为冻，很难进行下一步净化甚至是过滤试验。

发明内容

本发明提供一种预防高胶原蛋白含量的基质成冻的前处理方法，用以解决现有技术中在实际操作过程中存在的背景技术中存在的问题。

为解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种预防高胶原蛋白含量基质成冻的前处理方法，所述方法应用在中华人民共和国国家标准GB/T 22286-2008中，具体地，是对此标准中的提取步骤进行了改进，在提取步骤时加入乙酸铵缓冲盐溶液进行提取，步骤不变，但是会在酶解进行的同时，加入C₁₈粉、硫酸锌混匀，滴加几滴氢氧化钠溶液再离心，离心之后取其上清液。所述方法具体为：

(1)称取5g经捣碎的样品于50ml离心管中，加入18mL 2mol/L的乙酸铵缓冲溶液(pH＝5.2)，充分混匀，再加50μLβ-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶以及1g C₁₈粉、120g/L硫酸锌溶液2mL，滴加3-5滴1mol/L氢氧化钠溶液，混匀后，37℃水浴振荡水解12h；

(2)添加100μL 10ng/ml的内标工作液于待测样品中，加盖置于水平振荡器振荡15min，离心10min，取4ml上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5ml，混合均匀，用高氯酸调节pH值到1±0.3，10000r/min冷冻离心10min后，将全部上清液转移到50ml离心管中，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到11，加入10ml饱和氯化钠溶液和10ml异丙醇.乙酸乙酯混合溶液，充分提取，在10000r/min下冷冻离心10min。

所述方法还可以应用于中华人民共和国国家标准GB/T 21313-2007中，也是对该标准中的提取步骤进行了改进，具体方法为：