[发明专利]一种检测转基因大豆A2704-12的引物、探针及试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测转基因大豆A2704‑12的引物、探针及试剂盒和方法，引物组由2条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。检测试剂盒包括检测引物与探针溶液，检测方法是采用特异性引物及探针在重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶和核酸外切酶的作用下，在37～42℃对样品DNA模板进行扩增，通过对探针荧光信号收集的方法，判断样品是否含有转基因大豆A2704‑12成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点，适合现场检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体为一种利用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)快速检测转基因大豆A2704-12的引物与探针组合、试剂盒和检测方法。

背景技术

2016年全球转基因作物种植面积高达1.851亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，其中全球种植面积最大的为转基因大豆，2016年达到9140万公顷，占全球转基因作物总面积的50％。转基因大豆A2704-12是拜耳公司研发的一种抗除草剂转基因大豆，已被我国政府批准进口用作加工原料。针对转基因大豆A2704-12开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。

转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3～4h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。

RPA技术是一种新型的基因扩增技术，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并在链置换DNA聚合酶作用下启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。而RPA扩增体系中的引物与探针的选择较为困难，RPA的引物比一般PCR的引物要长，有30个左右碱基，而且目前也没有相关引物设计软件，因此获得高效的引物与探针组合是RPA的核心内容。该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件(37～42℃)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在30分钟内完成；③高特异性：重组酶与引物形成复合体，特异的寻找靶标序列，再加上探针的特异识别与信号收集，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：通过扩增荧光曲线的有无，对扩增产物进行便捷的检测。

RPA方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用RPA方法检测转基因大豆A2704-12的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种RPA检测转基因大豆A2704-12的引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测转基因大豆A2704-12的方法和试剂盒。

本发明具体通过以下技术方案实现：

根据转基因大豆A2704-12的转化体特异性的核苷酸序列，设计转基因大豆A2704-12的RPA检测引物，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，其核苷酸序列具体如下所示：

正向引物F：TGAGGGGGTCAAAGACCAAGAAGTGAGTTA(SEQ ID NO.1)；