[发明专利]一种高效提取子宫内膜间充质干细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种从经血中制备子宫内膜间充质干细胞及在卵巢早衰、子宫内膜损伤等治疗中应用的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使用月经杯采集女性经期中第一天到第四天的经血作为原料；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌管中，4℃保存。

2.2）0-72小时内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验，通过100-200μm筛网将经血中的子宫内膜组织与经血液体分离，然后分别从子宫内膜组织与经血液体中收集人子宫内膜组织。

3.3）从子宫内膜组织中提取间充质干细胞：剪碎的子宫内膜中加入约1-4倍体积由0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.05-2%的胶原酶组成的消化液，25℃—37℃消化15-60min，获得单细胞悬液。

4.4）从过滤后的经血液体中分离间充质干细胞：过滤后的经血液体加入1-5倍青/链霉素及两性霉素，置于冰箱2-8℃处理8-24 h。

5.5）过滤后的细胞沉淀中加入等体积生理盐水混匀，缓慢平铺于人淋巴细胞分离液的无菌离心管，1500-3000 rpm离心10-30min，收集中间白膜层细胞。

6.接种至培养瓶中，置于37℃、50ml/LCO₂和95％的相对空气湿度孵箱中培养。

7.6）将步骤3）中处理8-24h的滤液应用ficoll分离法获得中间薄膜层细胞，并对其进行原代培养。

8.7）将步骤5）和步骤6）分离获得的有核细胞置于子宫内膜间充质干细胞培养基中进行选择性培养，其梭形贴壁细胞即为所述子宫内膜间充质干细胞。

9.8）将步骤7）中获得的子宫内膜间充质干细胞用于卵巢早衰、子宫内膜损伤等疾病的治疗。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，经血中加入1-5倍体积含0.1%—5%青霉素、0.1%—5%链霉素及1-4μg/ml两性霉素B的生理盐水，混匀进行过滤。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，0-72小时内浸泡的子宫内膜使用100-200μm的筛网进行过滤分离，收集获得子宫内膜组织；

如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，剪碎的子宫内膜加入1-4倍体积的5-100U/ml DNA酶、0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.01-0.5%的胶原酶组成的消化液，并置于25℃—37℃消化15-60min，获得单细胞悬液。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，上清滤液中加入1-5倍体积含0.5%—25%青霉素、0.5%—25%链霉素及1-4μg/ml两性霉素B，置于冰箱4℃处理24h。

13. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，使用密度梯度离心方法收集白膜层，其收集过程采用1500-3000 rpm离心10-30min，离心采用缓慢停止的方式，收集后，种植于无菌培养用耗材中；

如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，将步骤3）中处理8-24h的滤液应用ficoll分离法获得中间薄膜层细胞，并对其进行原代培养。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）和步骤6)中有核细胞合并进行选择性培养，获得梭形贴壁的细胞进行传代培养。