[发明专利]一种高效提取子宫内膜间充质干细胞的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种子宫内膜间充质干细胞制备及在卵巢早衰、子宫内膜损伤等治疗中应用的方法，包括采用月经杯收集经血为原料；通过筛网过滤分离经血中的子宫内膜组织和经血液体；然后收集子宫内膜组织切碎后加入约10‑20ml消化液，消化获得单细胞悬液，并对其进行原代培养；对经血液体进行除菌处理，采用梯度离心法获得中间薄膜层细胞，并对其进行原代培养；对获得的原代子宫内膜间充质干细胞传代培养即获得子宫内膜间充质干细胞。将获得的子宫内膜间充质干细胞用于卵巢早衰、子宫内膜损伤等相关疾病治疗。使用本发明专利技术提供的子宫内膜间充质干细胞的提取方法，可维持子宫内膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力等。所用到的方法简单易行，操作方便，并且能最大量获得所需的干细胞，并培养成功。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，特别是涉及一种从废弃经血中制备子宫内膜间充质干细胞及在卵巢早衰、子宫内膜损伤等治疗中应用的方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）是一种成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，而且免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，因此在再生医学领域具有巨大的潜能。人的子宫内膜是一个高度再生组织，在育龄期妇女中要经历400多次的增殖、分化和脱落。近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力，这种成体干细胞被称为子宫内膜间充质干细胞。该子宫内膜间充质干细胞具有典型的间充质干细胞特性：具有自我更新和多向分化潜能，且具有间充质干细胞特异的标记分子表达。从经血中分离间充质干细胞可避免伦理争议，其来源丰富，变废为宝，在临床上可用于卵巢早衰、子宫内膜损伤等疾病治疗，具有广泛的应用价值。

目前，已有的经血中分离子宫内膜间充质干细胞的方法存在以下缺点：（1）月经血液高粘性和高渗透性，用水或铵盐溶解红细胞的效率很低，且不能协助分离脱落的子宫内膜组织，子宫内膜间充质干细胞易黏附。（2）对于大体积经血样本，使用梯度离心法分离子宫内膜间充质干细胞需要大量淋巴细胞分离液，使得分离成本较高，不利于产业化生产；且有明显的红细胞污染和凝结快，这些都会显著降低子宫内膜间充质干细胞的提取量。（3）对于子宫内膜间充质干细胞在卵巢早衰、子宫内膜损伤等疾病治疗方面方法有待进一步完善。因此，目前从经血中分离间充质干细胞的技术存在成本高、效率低的问题；对子宫内膜间充质干细胞在卵巢早衰、子宫内膜损伤等疾病中的方法有待完善。

发明内容

本发明的目的是提供了一种高效获得子宫内膜间充质干细胞及在卵巢早衰、子宫内膜损伤等治疗中应用的方法。该方法能够在较低成本的条件下，分离出大量、高质量的子宫内膜间充质干细胞，应用于产业化生产和临床使用。

本发明所提供的人子宫内膜间充质干细胞的分离培养用培养基，包括动物细胞基础培养基、胎牛血清（FCS）、表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）；所述胎牛血清的终浓度为1-200 mL/L，所述表皮生长因子的终浓度为0.1-150ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为0.1-150ng/ml。

其中，所述胎牛血清的终浓度优选为10-100 mL/L，尤其优选为10-30 ml/L；所述表皮生长因子的终浓度优选为5-50ng/ml；所述血小板衍生生长因子的终浓度优选为5-50ng/mll。

所述动物细胞基础培养基可为DMEM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME和IMEM等中的任意一种或其任意组合。