[发明专利]阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分:PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点扩增和测序引物4对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂；各引物的核苷酸序列如SEQ NO.5-12所示，具体见表1：

表1：引物序列

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

(1)PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点扩增和测序引物4对，引物序列参见表1；

(2)PCR扩增试剂：Taq酶混合液，包括dNTP、l0×PCR反应缓冲液和MgCl2；

(3)PCR产物纯化试剂：SAP酶混合物，包括SAP酶、ExoI酶和去离子水；

(4)测序试剂：包括BigDye mix、EDTA、乙醇溶液和Hi-Di。

3.采用如权利要求1或2所述试剂盒进行非疾病诊断目的检测阿司匹林个体化用药基因的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点区域PCR扩增；采用表1引物序列；

(3)PCR产物纯化

(4)DNA测序反应。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点区域PCR扩增；

所述步骤(2)PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点区域PCR扩增，采用表1引物序列；

每个反应体系为总体积50μL，包含Taq酶混合液25μL、去离子水17μL、引物对(5μM)3μL、基因组DNA(50ng/μL)2μL；PCR反应条件为95℃3分钟，进行35个循环的95℃30秒，56℃20秒，72℃30秒最后进行72℃5分钟；

(3)PCR产物纯化

每个反应体系总体积为5.6μL；PCR产物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物；反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；

(4)DNA测序反应

每个反应的体系为总体积10μL，PCR酶解产物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟；放入测序仪中。