[发明专利]SMN2基因多拷贝数的检测方法

权利要求书

1.SMN2基因多拷贝数的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，

比对SMN1和SMN2基因序列，确定两个基因之间的差异位点共有五个碱基差异，位于第6号内含子、第7号外显子、第7号内含子和第8号外显子上；

根据SMN2基因第6、7号内含子与SMN1基因第6、7号内含子上的差异碱基设计特异性扩增SMN2基因的引物；

在特异性扩增SMN2基因的引物3’端倒数第三个碱基处引入错配碱基；

针对SMN2基因设计特异性检测探针SMN2-P，在探针的5’端和3’端做标记；

针对RPP30基因设计特异性引物RPP30-F\RPP30-R和探针RPP30-P，在探针的5’端和3’端做标记；

步骤二，通过外周血提取标本DNA；

步骤三，制备PCR反应体系，进行PCR程序；

PCR反应体系包括：

补加去离子水至终体积为20～100μL。

经过PCR程序后，再进行标记采集，对拷贝数定量。

2.根据权利要求1所述的SMN2基因多拷贝数的检测方法，其特征在于，

步骤一，根据SMN2的第6号内含子差异位点设计两条特异性上游引物SMN2-F₀和

SMN2-F，所述SMN2-F₀将差异碱基放在引物3’末端最后一位；所述SMN2-F在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基G，产生强错配GT；

根据SMN2第7号内含子上的差异位点设计两条特异性下游引物SMN2-R₀和SMN2-R，所述SMN2-R₀是在引物3’端最后一个碱基覆盖差异碱基；所述SMN2-R在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基G，形成强错配GA；

根据SMN2基因设计特异性检测探针SMN2-P，5’端荧光标记FAM，3’端荧光标记TAMRA；根据RPP30基因设计特异性引物RPP30-F\RPP30-R和探针RPP30-P，探针5’端荧光标记HEX，3’端荧光标记TAMRA。

3.根据权利要求2所述的SMN2基因多拷贝数的检测方法，其特征在于，

SMN2-F₀引物序列为：CCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATA，

SMN2-R₀引物序列为：TTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTC，

SMN2-F引物序列为：CCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTGTA，

SMN2-R引物序列为：TTGTTTTACATTAACCTTTCAACTGTC，

SMN2-P探针序列为：CCTTACAGGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAG，5’端标记

FAM，3’端标记TAMRA，

SMN2-f引物序列为：ACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTG，

SMN2-r引物序列为：CTCTTTATTGTGAAAGTATGTTTCT，

RPP30-F引物序列为：GAGCTGATGCATATTTATACA，

RPP30-R引物序列为：TGAAATAATCTACAGGATACAGT，

RPP30-P探针序列为：TGACATAGTGTTCAGGATTCTTAAAGGTGA，5’端荧光标记HEX，3’端荧光标记TAMRA，

RPP30-f引物序列为：AGTATTTGTAATTCTGTTTGTATTG，

RPP30-r引物序列为：TGTAAACATCAGTGAATAGGA。

4.根据权利要求3所述的SMN2基因多拷贝数的检测方法，其特征在于，所述引物探针组合物包括：SMN2-F，SMN2-R，SMN2-P，RPP30-F，RPP30-R，RPP30-P。

5.根据权利要求1所述的SMN2基因多拷贝数的检测方法，其特征在于，探针的Tm值比引物高10℃±。