[发明专利]SMN2基因多拷贝数的检测方法

说明书

本发明公开了一种SMN2基因多拷贝数的检测方法，包括如下步骤：步骤一，根据SMN2基因第6、7号内含子与SMN1基因第6、7号内含子上的差异碱基设计特异性扩增SMN2基因的引物；在特异性扩增SMN2基因的引物3’端倒数第三个碱基处引入错配碱基；针对SMN2基因设计特异性检测探针SMN2‑P，在探针的5’端和3’端做标记；针对RPP30基因设计特异性引物RPP30‑F\RPP30‑R和探针RPP30‑P，在探针的5’端和3’端做标记；步骤二，通过外周血提取标本DNA；步骤三，制备PCR反应体系，进行PCR程序；对标记进行采集，对拷贝数定量；本检测方法成本低，且检测出的拷贝数定量的准确性高。

技术领域

本发明基因检测技术领域，特别是一种检测SMN2基因拷贝数变异的定量PCR方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是常染色体隐性遗传疾病，缺陷基因携带者频率可高达1/50。SMA的关键基因是运动神经元生存基因(Survival motorneuron， SMN)，SMN位于5号染色体长臂，包含高度同源的两拷贝，SMN1和SMN2。其中，SMN1是SMA的致病基因，约95％～98％的SMA患者是由于SMN1纯合缺失引起的，约2％～5％的患者是SMN1发生1拷贝缺失，另1拷贝存在点突变。SMN1与SMN2之间存在5个差异碱基，分布在内含子6到外显子8上。SMN1可以产生全长运动神经元蛋白，其同源基因SMN2 由于外显子7上的突变(c.840C＞T)导致SMN2基因产生可变剪接体，使产生的SMN蛋白不稳定或无功能，只有约10％的SMN2可以翻译成全长SMN蛋白。在SMN1纯合缺失患者中，SMN2在一定程度上可以起到补偿作用，与疾病的严重程度有关，其拷贝数越多，患者表型越轻，预后越好。在正常个体中SMN2的拷贝数可以从0到6变化。

检测SMN基因拷贝数变异的方法有单链构象多态性分析、变性高效液相色谱分析、高分辨熔解曲线分析、多重连接依赖性探针扩增技术和实时定量PCR技术等。单链构象多态性分析根据具有空间构象差异的单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的受排阻力不同来实现突变检测，该方法操作繁琐，容易出现假阳/阴性，而且对SMA携带者无法检测。变性高效液相色谱分析可根据异源双链和同源双链的色谱柱洗脱差异进行检测，高自动化、高通量，可同时对SMN1、SMN2基因拷贝数进行检测，应用广泛，缺点是易受温度、洗脱剂等的影响，导致结果稳定性差，且需要PCR后处理，容易造成污染。高分辨熔解曲线分析法是根据熔解峰峰型差异对突变进行检测，该方法检测结果需要人工判读，准确性差，而且对模板的质量要求较高。MLPA是一种准确、快速的拷贝数检测方法，但当探针结合区存在SNP时，结果会不准确，可能造成假阳性，而且操作难度较大，成本高，对标本纯度要求高。

市场需要一种成本低，且拷贝数定量的准确性高的SMN2基因多拷贝数的检测方法，据相关文献和专利报道，qPCR一般可用于检测SMN1和SMN2基因低拷贝数，对SMN2基因 4拷贝以上的分辨率较低，而区别高拷贝SMN2对SMA疾病类型的判断以及指导临床预后有重要意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种SMN2基因多拷贝数的检测方法，能够快速、简便的检测出SMN2变异的拷贝数，检测方法成本低，且检测出的拷贝数定量的准确性高。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

SMN2基因多拷贝数的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，

比对SMN1和SMN2基因序列，确定两个基因之间的差异位点共有五个碱基差异，位于第6号内含子、第7号外显子、第7号内含子和第8号外显子上；

根据SMN2基因第6、7号内含子与SMN1基因第6、7号内含子上的差异碱基设计特异性扩增SMN2基因的引物；

在特异性扩增SMN2基因的引物3’端倒数第三个碱基处引入错配碱基；