[发明专利]长春花细胞高产长春碱的培养方法

权利要求书

1.一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/L维生素C、7-9g/L琼脂和0.1-0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；

2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；

3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10-15天开始，将培养温度从32-35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2-3天后，恢复培养温度到32-35℃，培养4-5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。

2.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为含有1～2mg/L细胞分裂素、0.1～0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、20～30g/L蔗糖、3-5mg/L甘草黄酮和5～8g/L琼脂的B5基础培养基。

3.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为0.5～1.0mmol/L。

4.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的B5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005-0.008mg/L，白藜芦醇的浓度为0.001-0.003mg/L，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08-0.1mg/L，萘乙酸的浓度为0.2-0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06-0.09mg/L、蔗糖的浓度为20-30g/L的B5基础培养基。

5.根据权利要求4所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述液体培养基中还包括色氨酸和水解酪蛋白，所述色氨酸的浓度为20-30mg/L，所述水解酪蛋白的含量为50-70mg/L。

6.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述一氧化碳的通入量为0.01-0.03m³/h。

7.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，所述尼克酸的浓度为0.05-0.1mg/L，所述蜕皮激素的浓度为0.06-0.08mg/L，所述硫代硫酸银的浓度为0.02-.0.05mg/L。