[发明专利]长春花细胞高产长春碱的培养方法

说明书

本发明提供一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其包括以下步骤：1)培育长春花愈伤组织；2)培育稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10‑15天开始，将培养温度从32‑35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2‑3天后，恢复培养温度到32‑35℃，培养4‑5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。本发明具有细胞生长速度快、长春碱累积含量高等特点。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种长春花细胞高产长春碱的培养方法。

背景技术

长春花，别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为夹竹桃科长春花属一种植物。目前，已经从长春花中分离出了100多种萜类吲哚生物碱，如长春碱、长春新碱、蛇根碱、文多灵碱等，从长春花中分离出来的许多生物碱均具有抗肿瘤活性，其中，长春碱是目前长春花中药用价值最大的、应用最广泛的生物碱。然而，长春花植株体内的长春碱含量及其微少，使得从长春花植株中提取的长春碱远远不能满足市场需求。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在液体悬浮培养基中含有尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的情况下通入一氧化碳后能提高长春花细胞中长春碱的含量。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其能够促进长春花细胞的生长、提高单位时间单位体积培养液中的细胞含量，进而提高长春碱的含量。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其包括以下步骤：

1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/L维生素C、7-9g/L琼脂和0.1-0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；

2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；

3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10-15天开始，将培养温度从32-35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2-3天后，恢复培养温度到32-35℃，培养4-5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。

优选的是，所述愈伤组织诱导培养基为含有1～2mg/L细胞分裂素、0.1～0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、20～30g/L蔗糖、3-5mg/L甘草黄酮和5～8g/L琼脂的B5基础培养基。

优选的是，所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为0.5～1.0mmol/L。