[发明专利]一种提取橡胶树叶片总DNA的方法

说明书

本发明公开了一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，涉及植物提取技术领域，在细胞核裂解前用提取缓冲液对样品进行预处理，使细胞质中的大部分多糖和多酚类物质溶解在提取缓冲液中，通过低速离心使之与含有总DNA的样品分离；提取缓冲液中用葡萄糖作稳定剂，以保持渗透性；提取缓冲液中用高浓度的聚乙烯吡咯烷酮结合多酚类物质；提取缓冲液中用高浓度巯基乙醇作抗氧化剂；裂解液中提供高浓度的氯化钠环境，使CTAB与DNA的复合物能充分溶解。

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种提取橡胶树叶片总DNA的方法。

背景技术

橡胶树体内不仅富含胶乳，而且有大量的多酚及多糖类次生物质。在提取DNA时，多糖很难与DNA分离，而酚类物质在研磨时易氧化，并与蛋白质和核酸发生不可逆的结合，形成胶状物，这种含有DNA的胶状物对其进行PCR或酶切分析不利。虽然提取橡胶树中DNA有多种方法，但这些方法均需用氯化铯超速离心，而且产物经常呈褐色的胶状物。要提取高质量的DNA，就得克服多酚及多糖类物质的干扰。因此，亟需一种适合于提取橡胶树中高质量DNA的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，所得DNA没有蛋白质、酚类及小分子的污染，适合于分子生物学研究。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，包括以下步骤：

取橡胶树叶片，放在液氮中研成粉末后转入离心管中，在离心管中加入提取缓冲液，低温离心；

弃去上清液，沉淀中加入55～75℃预热的裂解液，于55～75℃水浴中保温；

加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，于室温下离心；

上清液转至另一新管中，加入异丙醇，于室温下离心；

以乙醇洗沉淀，沉淀风干后，加入TE缓冲液，溶于微量离心管中，加入核糖核酸酶，于室温下保温；

加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，低温离心；

弃去上清液，加入醋酸钠，混匀后加入无水乙醇，翻转混匀，于-15℃～-25℃中静置；

低温离心，用乙醇洗沉淀，沉淀风干后，将沉淀溶于TE缓冲液中，于-15℃～-25℃下保存。

在上述方案的基础上，橡胶树叶片与提取缓冲液比例为1∶5～1∶7。

在上述方案的基础上，所述提取缓冲液为0.45M的葡萄糖、0.1mM的Tris-HCl、5mM的EDTA、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮和2％物质浓度的β-巯基乙醇。

在上述方案的基础上，所述裂解液为2％质量浓度的CTAB、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮、1.4M的NaCl、20mM的EDTA、0.1M的Tris-HCl和2％物质浓度的巯基乙醇。

在上述方案的基础上，所述TE缓冲液为10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA。

在上述方案的基础上，所述Tris-HCl的PH值为7.1～8.0。

在上述方案的基础上，所述EDTA的PH值为7.1～8.0。

在上述方案的基础上，所述酚∶氯仿∶异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。

在上述方案的基础上，所述氯仿∶异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1。

在上述方案的基础上，所述醋酸钠浓度为3mol/L。

与现有技术相比，本发明的优点在于：