[发明专利]一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法

说明书

本发明属于生物制品领域，涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。本发明的制备方法，包括以下步骤：以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备，制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚和层析精纯，最终得到肺炎球菌荚膜多糖，其中，控制粘度的步骤包括：超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。

背景技术

肺炎球菌是革兰氏阳性菌，具有荚膜，为多糖抗原。肺炎球菌可引起多种疾病，如肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等，病情较严重，病死率高，因此，发展预防性疫苗成为一种迫切需求。目前市场上用于预防肺炎球菌感染的有23价肺炎球菌多糖疫苗，10价、13价肺炎球菌多糖结合疫苗，其中23价肺炎球菌多糖疫苗用于成年人，10价、13价用于儿童。多糖疫苗和多糖结合疫苗均需要使用肺炎球菌的荚膜多糖作为原材料进行制备。

肺炎球菌的血清型多达90多种，制备方法与标准差异较大，本发明涉及的方法能够有效的用于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌多糖的制备。

多糖制备的过程分析与控制大多根据多糖浓度、杂质浓度等指标展开。如层析纯化时，对层析样品进行检测，计算多糖和杂质的含量后，根据层析填料的载量得出具体的上样体积。但不同血清型的多糖在相同浓度的情况下粘度差异很大，对于粘度较大的多糖，层析纯化的过程中容易受到粘度的干扰，影响溶液在层析填料中的流动状态，导致杂质去除不充分。对于与膜相关的操作，如超滤、过滤等过程，粘度较大会直接影响大分子的过膜状态，导致多糖分子量不稳定，Kd值指标容易超标。所以粘度也是多糖制备中关键的影响因素。

粘度是物质的一种物理化学性质，反应了外力作用下发生变形的流体因抗拒变形而产生的相邻两流体层间的内摩擦力。粘度一般应用于化工和食品行业中，如通过粘度对样品进行条件或者组分的分析。现代医学也有针对于生物样品的相关研究。在生物制品行业，特别是疫苗行业中较少提及，主要因为生物制品的质量控制方法多样，质量标准严苛，理化、生物的方法构成了生物制品行业质量控制的主要手段。

但是常用检测手段过程较复杂，检验周期较长。如使用蒽酮硫酸法测定多糖含量，需要用到称量、移液、加热、比色等多步操作，连同前期的准备工作，整个检测过程至少需要2-3个小时。而粘度的检测方法操作简便、快速，锥板式粘度计或旋转式粘度计均可在几分钟内测出样品粘度值，相比于理化检测的滞后性具有明显的优势。

由于溶液粘度与多糖浓度正相关，并且粘度体现较为直观，经常作为一种感官指标，仅依靠经验进行判断，没有具体进行检测得出粘度值，所以批间差异较大。结合不同工艺特点，确定不同血清型各步骤的最佳粘度值，能有效的增加产品收获率，提高产品质量。

在超滤阶段，浓缩体积的选择是该工艺的关键，在优化流速和TMP的情况下，粘度会影响透过液的流量和透析效果。浓缩体积过小会使透过流速变慢，并且高粘度状态会影响透析液的置换效果；浓缩体积过大会在透析倍数相同的情况下降低效率，同时因体积变大增加下游工艺的压力。超滤阶段控制粘度能够更好的避免过度浓差极化、提高效率、保证效果。

在澄清过滤阶段，溶液的粘度会显著影响过滤的效果。粘度大的溶液在过滤时容易造成滤芯过快堵塞，并且会影响多糖的回收率；稀释倍数过大会降低效率，同时因体积变大增加下游工艺的压力。控制合适的粘度能够在保证回收率的情况下更好的达到澄清效果。

在CTAB聚合多糖阶段，只对CTAB终浓度进行控制，可能会因为糖浓度的不同使聚合过程不充分。粘度过大的溶液糖浓度较高，可能导致CTAB总量不足，并且影响搅拌效果，使局部反应浓度过高，影响反应的均一性；稀释倍数过大，加大了CTAB的添加量，同时增加了下游工艺的压力。