[发明专利]一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法在审
| 申请号： | 201811233149.9 | 申请日： | 2018-10-23 |
| 公开（公告）号： | CN109402033A | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 蔡佳佳;亓正良;刘浩 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01 |
| 代理公司： | 天津市三利专利商标代理有限公司 12107 | 代理人： | 李蕊 |
| 地址： | 300000 天*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 类球红细菌 葡萄糖 高效利用 工程菌 构建 敲除 工程菌株 菌体细胞 基因 菌株 消耗 应用 | ||
1.一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌2.4.1工程菌株。
2.根据权利要求1所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：是通过用连接有fruA-LR、gcd-LR序列的载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR敲除fruA、gcd基因获得的。
3.根据权利要求2所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌特异性无缝敲除fruA、gcd基因的具体构建方法为：所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，所述载体为pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR；敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR化转至大肠S17-1感受态中，再通过接合转移的方法，将含有敲除载体的S17-1与类球红细菌2.4.1共同培养，敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR将会被导入至类球红细菌2.4.1，而后，通过提取基因组进行验证，如果fruA基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出2015bp大小的片段，如果gcd基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出1815bp大小的片段，即获得fruA和gcd基因双敲除的类球红细菌菌株。
4.根据权利要求2所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：所述载体pK18mobsacB::fruA-LR中包括fruA左臂右臂1819bp重叠序列fruA-LR，其中，类球红细菌中fruA左臂979bp序列fruA-L，其基因序列见序列表1、2；fruA右臂834bp序列fruA-R，其基因序列见序列表3、4。
5.根据权利要求4所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：所述fruA左臂基因fruA-L和fruA右臂基因fruA-R通过重叠PCR获得重叠基因fruA-LR，将重叠基因fruA-LR和出发载体pK18mobsacB分别用EcoRI和SalI双酶切后进行连接，构建fruA-LR基因的敲除载体，为pK18mobsacB::fruA-LR。
6.根据权利要求2所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：所述载体pK18mobsacB::gcd-LR中包括gcd左臂右臂1709bp重叠序列gcd-LR，其中，类球红细菌中gcd左臂770bp基因gcd-L，其基因序列见序列表5、6；gcd右臂976bp基因gcd-R，其基因序列见序列表7、8。
7.根据权利要求6所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：所述gcd左臂基因gcd-L和gcd右臂基因gcd-R通过重叠PCR获得重叠基因gcd-LR，将重叠基因gcd-LR和出发载体pK18mobsacB分别用EcoRI和SalI双酶切后进行连接，构建gcd-LR基因的敲除载体，为pK18mobsacB::gcd-LR。
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