[发明专利]一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法

说明书

本发明涉及一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法，为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌2.4.1工程菌株，是通过用连接有fruA‑LR、gcd‑LR序列的载体pK18mobsacB::fruA‑LR、pK18mobsacB::gcd‑LR敲除fruA、gcd基因获得；所述类球红细菌菌株消耗单位质量的葡萄糖益于获得更多菌体细胞，降低生产成本，显现出良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及类球红细菌生产领域，尤其是一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法。

背景技术

类球红细菌富含多种营养药用成分，具有抗脂质过氧化、抗辐射、抗肿瘤、调节机体免疫等功能，在食品、医药领域有了新应用。可从菌体中提取辅酶Q₁₀、番茄红素、维生素B₁₂、超氧化物歧化酶等营养药用成分。目前利用类球红细菌发酵辅酶Q₁₀已实现产业化。随着研究的深入，该菌在食品、医药领域更多潜在的功用将被挖掘出来，获取大量的菌体细胞对生产上述营养药用成分具有重要意义。

葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质，因此在微生物生长过程中，高效利用葡萄糖对其生长具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌(类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1工程菌株。

优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，是通过用连接有fruA-LR、gcd-LR序列的载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR敲除fruA、gcd基因获得的。该方法实现了特异性无缝敲除，且效率高、稳定，可重复得到完全相同的类球红细菌工程菌。

上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌特异性无缝敲除fruA、gcd基因的具体构建方法：所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，所述载体为pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR；敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR化转至大肠S17-1感受态中，再通过接合转移的方法，将含有敲除载体的S17-1与类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1共同培养，敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR将会被导入至类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1，而后，发生左右臂同源交换获得敲除菌株，同源重组原理见图8，提取基因组进行验证，如果fruA基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出2015bp大小的片段，如果gcd基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出1815bp大小的片段，即获得fruA和gcd基因双敲除的类球红细菌菌株。

优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，所述载体pK18mobsacB::fruA-LR中包括fruA左臂右臂1819bp重叠序列fruA-LR，其中，类球红细菌中fruA左臂979bp序列fruA-L，其基因序列见序列表1、2；fruA右臂834bp序列fruA-R，其基因序列见序列表3、4。