[发明专利]一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法。本发明将鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联形成特异性免疫磁珠；利用鼠李糖乳杆菌活细胞对样品中的噬菌体颗粒进行吸附，离心、洗涤后重悬于缓冲液；应用免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌‑噬菌体复合物、磁场分离、PBS洗涤后，以磁性玻碳电极作为工作电极，铅丝与饱和甘汞电极作为对电极和参比电极，测定样品和对照中的电阻值差异，对样品中噬菌体实现快速定量检测。本发明操作简便，无需培养、耗时短、便于推广使用，适合鼠李糖乳杆菌高密度发酵制备中环境和原材料中噬菌体的检测，便于快速确定污染来源和途径，采取综合防治措施。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法。

背景技术

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是目前公认的益生性乳杆菌，具有保持肠道微生态平衡，抑制有害细菌生长，消除过敏等生理功能，已被广泛应用于食品补充剂及益生菌产品中。发酵制备高密度鼠李糖乳杆菌菌粉是功能乳制品及益生菌保健产品的基础，目前该产业目前已经产生了巨大经济与社会效益。然而在发酵过程中，乳酸菌常受到噬菌体侵染，导致活性减弱，发酵迟缓，产品质量下降而造成经济损失。因此克服噬菌体危害是工业化浓缩型菌粉生产中一个亟待解决的问题。

鼠李糖乳杆菌噬菌体广泛分布于工厂周边环境、原材料、操作人员、空气与设备、污染来源和途径十分复杂。建立快速准确的噬菌体检测方法对于确定污染源头，采取综合防治措施具有十分重要的意义。常规的双层琼脂平板法是目前使用最广泛的噬菌体检测方法，但是检测周期长，通常需要培养24 h以上，在时效性上难以满足发酵生产的要求。近年来PCR技术被应用于快速检测乳杆菌噬菌体和乳酸链球菌噬菌体，虽然检测周期短，但是检测成本高昂，并且只能检测到特定引物靶点噬菌体，噬菌体变异以及靶基因缺失容易造成漏检。利用生物传感器技术检测噬菌体成本低廉、检测灵敏、快捷，但尚处于起步阶段，目前针对鼠李糖乳杆菌工业菌株的噬菌体检测还没有相应方法建立。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，应用鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性抗体制备免疫磁珠，联合电化学传感器建立鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量测定方法，为高密度菌粉大规模工业化生产中噬菌体防治提供新技术；主要包括鼠李糖乳杆菌活细胞对样品中的噬菌体颗粒的吸附分离和免疫磁珠对鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物捕获分离及电化学定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，包括如下步骤：

1）鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，得到SpaA抗体偶联的纳米磁珠；

2）鼠李糖乳杆菌特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；

3）步骤1）制得的SpaA抗体偶联的纳米磁珠捕获与分离步骤2）制得的鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；

4）免疫磁珠电化学传感器定量检测样品中的噬菌体含量。

步骤1）中，选择SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，作为鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物的免疫磁珠。

步骤2）中，以鼠李糖乳杆菌活细胞特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，通过离心和PBS洗涤，去除非特异性吸附颗粒，以得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物。

步骤3）中，以SpaA抗体偶联的纳米磁珠特异性捕获鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物，再通过磁场分离、PBS洗涤，获得SpaA抗体偶联的纳米磁珠-鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物。

步骤4）中，以磁性玻碳电极作为工作电极，铅丝与饱和甘汞电极分别用作对电极和参比电极，在铁氰化钾溶液中测定样品和对照中的电阻值差异，根据标准曲线对样品中噬菌体进行定量。