[发明专利]一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法

权利要求书

1.一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；

2)制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；

3)将尿液在亲和层析柱上样，上样后在室温下静置；

4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱组分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述尿液为哺乳动物尿液，优选为人的尿液；优选地，所述尿液为从公共厕所收集的人排出体外的尿液，对所述尿液进行过滤，所述过滤采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行，或者所述过滤先采用20nm≤孔径的超滤膜进行，然后再采用10nm≤孔径≤15nm的纳滤膜进行；

优选地，所述透析为自由扩散透析或搅拌透析，包括以1-2倍体积的缓冲溶液对尿液透析过夜或透析6-8hr，其中所述缓冲溶液为50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)；

优选地，所述透析先在水中透析过夜，然后在所述缓冲溶液中透析过夜。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离心包括：将透析液在10,000g-12,000g的重力下离心40min-60min；

优选地，所述过滤包括取离心得到的上清液，经0.22μm滤器过滤。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述CibacronBlue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂通过偶联Cibacron Blue F3-GA和琼脂糖凝胶例如Sepharose 4B制备得到；

优选地，所述制备Cibacron Blue F3-GA-琼脂糖凝胶亲和吸附剂包括以下步骤：

A.水洗得到湿琼脂糖凝胶，并在室温下分散在体积为干胶体积至少十倍的水中，混匀；

B.将Cibacron Blue F3-GA在室温下溶解于至少十倍体积的水中，混匀；

C.在温和搅拌下，使Cibacron Blue F3-GA与湿琼脂糖凝胶以1:100的质量比充分混合；

D.加入20％氯化钠溶液，室温下放置30min，再加入15％碳酸钠溶液，室温下偶联1h，得到亲和吸附剂；

E.用10-30℃、优选20-25℃的水、6M尿素和1％碳酸钠溶液依次洗涤亲和吸附剂，直至洗涤液无色。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述装柱得到柱体积为10-25ml、优选10ml的亲和层析柱；

优选地，所述平衡中，以20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲溶液(pH＝6.5-7.2)或10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5-8.0)作为平衡缓冲溶液，以1-3ml/min的流速冲洗亲和层析柱；

优选地，所述平衡中采用至少3倍柱体积的平衡缓冲溶液。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述上样包括将经步骤1)得到的尿液以1-3ml/min的流速流过步骤2)中制备的亲和层析柱；

优选地，所述尿液的体积为亲和层析柱中的亲和层析介质的体积的2-6倍、优选2.5-3倍；

优选地，所述静置包括在室温下静置30min-1hr。