[发明专利]多潜能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法

权利要求书

1.诱导性多功能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，其特征在于：它包括，

步骤（1）第0天至第7天：诱导性多功能干细胞在CHIR99021、SB431542和DMH1的作用下分化得到神经上皮细胞；

步骤（2）第7天至第14天：加入环巴胺和视黄酸进行持续诱导分化，得到脊髓神经前体细胞；具体过程为：

Ⅱ阶段培养基配制，将24.5mL DF-12、24.5mL Neurobasal加入到50mL离心管中，后加入500μL NEAA、500μL N2、1mL B27、100μL SB431542、50μL CHIR99021、100μL DMH1、5μLRA、25μL环巴胺；

铺MEF用移液枪吸取六孔板里的原培养基，DF-12洗两遍，加入Ⅱ阶段培养基，用1mL移液枪吹下克隆，按1:8的比例将细胞铺到MEF饲养层细胞上，每孔培养基加至2mL，每天半换液，直到第14天；

步骤（3）第14天至第21天：经消化处理后，继续在环巴胺和视黄酸的作用下进行分化，得到脊髓GABA能中间神经元，具体过程为：

Ⅲ阶段培养基配制，将24.5mL DF-12、24.5mL Neurobasal加入到50mL离心管中，后加入500μL NEAA、500μL N2、1mLB27、5μL RA、25μL环巴胺；

用移液枪吸取六孔板里的原培养基，DF-12洗两遍，加入Ⅲ阶段培养基，用1mL移液枪吹下克隆，按2:1比例将细胞悬浮液移入T25培养瓶中，培养基加至10mL，每天用1mL移液枪吹打神经球，防止粘连，隔天半换液，直至第21天；

以及，

步骤（4）经消化处理后，将所述脊髓GABA能中间神经元进行贴壁培养使其成熟；贴壁培养时间为3~4周；

所述环巴胺的摩尔浓度为5nM，所述视黄酸的摩尔浓度比为1nM。

2.根据权利要求1所述的诱导性多功能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，其特征在于：所述CHIR99021的摩尔浓度为3μM、所述SB431542的摩尔浓度为2μM，所述DMH1的摩尔浓度2μM。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的诱导性多功能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，其特征在于：步骤（1）~步骤（4）中所需细胞培养液均由临床级别的培养基和临床级别的添加剂制备得到。