[发明专利]一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法

权利要求书

1.一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体，其特征在于：包括保藏号为CGMCC No.16296的克隆载体和CGMCC No. 16297的克隆载体，于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。

2.一种如权利要求1所述的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：

（1）从感染南瓜花叶病毒的南瓜叶片中提取植物总RNA；

（2）利用植物总RNA获得南瓜花叶病毒全长序列；

（3）以获得的序列为基础，并结合植物表达载体pXT1序列，分别设计南瓜花叶病毒两个组分RNA1和RNA2的三对引物，

组分RNA1的引物序列如下：

HF-RNA1-1F：如SEQ ID NO.3所示， RNA1-2597R：如SEQ ID NO.4所示； RNA1-2576F：如SEQ ID NO.5所示；RNA1-4632R：如SEQ ID NO.6所示； RNA1-4613F：如SEQ ID NO.7所示；HF-RNA1-5858R：如SEQ ID NO.8所示，

组分RNA2的引物序列如下： HF-RNA2-1F：如SEQ ID NO.9所示； RNA2-939R：如SEQ IDNO.10所示，RNA2-921F：如SEQ ID NO.11所示；RNA2-2362R：如SEQ ID NO.12所示；RNA2-2339F：如SEQ ID NO.13所示；HF-RNA2-3386R如SEQ ID NO.14所示；

（4）利用引物HF-RNA1-1F/RNA1-2597R、RNA1-2576F/RNA1-4632R和RNA1-4613F/HF-RNA1-5858R分别对组分RNA1进行扩增，获得长度约2617 bp、2057 bp和1266 bp的三个片段，利用同源重组方式将这三个片段与经Stu I和SmaI双酶切的pXT1载体进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA1，即为保藏号为CGMCC No. 16296的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体；

（5）利用引物HF-RNA2-1F/RNA2-939R、RNA2-921F/RNA2-2362R和RNA2-2339F/HF-RNA2-3386R分别对组分RNA2进行扩增，获得长度为959 bp、1442 bp和1068 bp的三个片段，利用同源重组方式将这三个片段与经Stu I和Sma I双酶切的pXT1载体进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA2，即为保藏号为CGMCC No. 16297的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体。

3.根据权利要求2所述的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，特征在于：将所述的重组载体pSqMV-RNA1和pSqMV-RNA2采用液氮冻融法导入农杆菌菌株 GV3101。