[发明专利]一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法

说明书

本发明涉及一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法，以南瓜花叶病毒为材料，将基因组5.8Kb RNA1和3.3Kb RNA2构建到植物表达载体pXT1中，获得以农杆菌介导的对寄主植物有高效侵染能力的病毒载体pSqMV‑RNA1和pSqMV‑RNA2。本发明为研究该病毒各基因组、各基因的结构与功能及其与寄主之间的互作奠定了基础，也为揭示该病毒种传机制提供了新的方法。

技术领域

本发明涉及一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法，属于基因工程领域。

背景技术

南瓜花叶病毒( Squash mosaic virus，SqMV) 属于小RNA 病毒目，伴生豇豆病毒科，豇豆花叶病毒亚科，豇豆花叶病毒属的成员，是葫芦科作物上一种重要的种传病毒。该病毒的主要寄主是甜瓜、西瓜、黄瓜、笋瓜、南瓜、西葫芦等葫芦科作物，但也侵染灰菜等藜属植物。根据该病毒不同株系是否可以侵染西瓜，以及在甜瓜、南瓜上所诱导产生的症状的严重程度有所差异，可将其分成I和II两组。其中，I组株系在甜瓜上所诱导产生的症状较在南瓜上严重，有一部分株系可侵染西瓜，II组株系均不可侵染西瓜，且在南瓜上所诱导产生的症状较在甜瓜上严重。该病毒在自然界中主要通过种子和介体昆虫传播。种子传播率通常从0.1%到10%，商业性和试验种子产生大约10% 的被感染幼苗。南瓜花叶病毒在世界各大洲均有报道，但还有许多国家没有报道发生。由于该病毒可以通过种子传播且种传率也比较高，随着种子贸易的日益频繁，该病毒很可能在葫芦科作物的生长区域均有分布。一方面，该病毒可以通过种子从已发生区域传入未发生的新区域，成为一个地区新的病毒病害;另一方面，该病毒通过种子从上一生长季节传播给下一个生长季节，成为病毒病害重要的初侵染源，即使在很低的种传率情况下，通过传播介体、农事操作等途径，很容易造成该病毒病害的大面积发生。因此研究该病毒基因组的结构与功能及其致病机制具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法，构建了南瓜花叶病毒的侵染性克隆载体, 为研究该病毒基因组的结构与功能及其致病机制奠定了基础，解决了上述问题。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体，包括保藏号为CGMCC No.16296的克隆载体和CGMCC No. 16297的克隆载体，分类命名为南瓜花叶病毒，于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，详细地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明也提供了一种南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）从感染南瓜花叶病毒的南瓜叶片中提取植物总RNA；

（2）利用植物总RNA获得南瓜花叶病毒全长序列；

（3）以获得的序列为基础，并结合植物表达载体pXT1序列，分别设计南瓜花叶病毒两个组分RNA1和RNA2的三对引物，

HF-RNA1-1F：如SEQ ID NO.3所示， RNA1-2597R：如SEQ ID NO.4所示； RNA1-2576F：如SEQ ID NO.5所示；RNA1-4632R：如SEQ ID NO.6所示； RNA1-4613F：如SEQ IDNO.7所示； HF-RNA1-5858R：如SEQ ID NO.8所示，

组分RNA2的引物序列如下： HF-RNA2-1F：如SEQ ID NO.9所示； RNA2-939R：如SEQID NO.10所示，RNA2-921F：如SEQ ID NO.11所示；RNA2-2362R：如SEQ ID NO.12所示；RNA2-2339F：如SEQ ID NO.13所示；HF-RNA2-3386R如SEQ ID NO.14所示；