[发明专利]重组纤维素内切酶基因及其蛋白和蛋白制备方法

说明书

本发明涉及一种重组纤维素内切酶基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种可以高效表达且纯化该重组蛋白的方法，不仅纯化后的蛋白纯度高达95％，蛋白浓度也较高，且具有水解纤维素产生葡萄糖的酶活性，这对于生物燃料乙醇的生产、食品、饲料等行业有重要的工业价值。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及重组纤维素内切酶基因，还涉及该基因所编码的蛋白和蛋白制备方法。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量最丰富的可再生性资源。目前，纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。

随着石油和煤炭资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布最广、最丰富也最廉价的可再生性有机资源和多糖物质，是我国关注的重要研究领域。所以利用纤维素酶降解纤维素，使其转化成燃料、食物和化学制品，如糖，乙醇，饲料蛋白等，对缓解能源危机，食品和饲料资源紧张有重大的经济意义，纤维素酶将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等领域中发挥重要作用。目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制，因此，需要克服纤维素酶大量生产的瓶颈。深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别要充分利用DNA基因重组技术的应用，生产具有高酶活的重组蛋白。纤维素酶系包含内切酶、外切酶和糖苷转移酶3种酶。其中，纤维素内切酶对纤维素的分解起重要作用。目前市售纤维素酶都是各种酶的混合物，很少有利用基因工程手段获得大最高纯度和高活性的纤维素内切酶的相关产品和技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组纤维素内切酶基因，以及这种基因所编码的蛋白，本发明还提供一种构建含有SEQ ID NO.1基因序列的重组载体，更提供一种高效表达且纯化该重组蛋白的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.重组纤维素内切酶编码基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；