[发明专利]一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法在审
| 申请号： | 201811242616.4 | 申请日： | 2018-10-24 |
| 公开（公告）号： | CN109517058A | 公开（公告）日： | 2019-03-26 |
| 发明（设计）人： | 鲁亮;雷坤;秦伏波;张永霞 | 申请（专利权）人： | 普健生物（武汉）科技有限公司 |
| 主分类号： | C07K16/00 | 分类号： | C07K16/00;C12N15/70;C12N15/13;G01N15/14;G01N33/53 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 徐瑛;祝蓉蓉 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 筛选 流式细胞术 抗原 抗体 细胞融合 细胞 背景干扰 工作效率 抗体生产 抗原表达 快速筛选 免疫抗原 实验处理 实验设计 小鼠免疫 亚克隆 二抗 流式 通透 小鼠 效价 工作量 应用 蛋白 | ||
1.一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抗原表达及纯化，所述抗原包括免疫抗原、筛选抗原、流式筛选抗原；所述抗原含有MATX的cDNA基因序列，所述cDNA的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
(2)小鼠免疫，筛选效价高的小鼠做细胞融合；
(3)预实验处理，获取通透处理的细胞，所述细胞可表达MATX-GFP-His蛋白，所述MATX-GFP-His蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
(4)细胞融合和筛选；
(5)亚克隆；
(6)抗体生产。
2.如权利要求1所述的一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：
A、免疫抗原表达及纯化：将MATX的cDNA基因序列利用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切定向插入到E.coli pT7质粒中，得到免疫抗原表达载体质粒，将所述免疫抗原表达载体质粒转入大肠杆菌进行表达获得免疫抗原蛋白，并过镍柱纯化免疫抗原蛋白，所述免疫抗原载体质粒的N末端带His标签，所述免疫抗原载体质粒的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
B、筛选抗原表达及纯化：将MATX的cDNA基因序列利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切定向插入pATX1质粒中，得到质粒pATX1-6His-MATX，将质粒pATX1-6His-MATX转入哺乳动物细胞表达获得筛选抗原蛋白，并过镍柱纯化筛选抗原蛋白，所述质粒pATX1-6His-MATX的N末端带His标签和Kozak片段，所述质粒pATX1-6His-MATX的碱基序列如序列表SEQ IDNO.4所示；
C、流式筛选抗原表达及纯化：将MATX的cDNA基因序列利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切定向插入到pATX1-GFP质粒中，得到质粒pATX1-GFP-6His-MATX，然后转入哺乳动物细胞表达获得流式筛选抗原蛋白，所述流式筛选抗原蛋白氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.5所示，所述pATX1-GFP-6His-MATX质粒的N末端带His标签、GFP标签、Kozak片段；
其中，所述免疫抗原蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，所述筛选抗原蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。
3.如权利要求1所述的一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤为，将步骤(1)中获得的抗原对小鼠进行免疫，并进行elisa效价和流式检测筛选小鼠做细胞融合。
4.如权利要求1所述的一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，其特征在于，步骤(3)包括预实验一和预实验二，所述预实验一用于确定二抗选择及最适工作浓度，所述预实验二用以验证二抗最适工作浓度及流式细胞仪检测参数设定,所述二抗包括Jackson抗体和Immunoreagent抗体。
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