[发明专利]一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法

说明书

本发明公开一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，包括以下步骤：(1)抗原表达及纯化，所述抗原包括免疫抗原、筛选抗原、流式筛选抗原；(2)小鼠免疫，筛选效价高的小鼠做细胞融合；(3)预实验处理，获取通透处理的细胞，所述细胞可表达MATX‑GFP‑His蛋白；(4)细胞融合和筛选；(5)亚克隆；(6)抗体生产。通过预实验设计确定二抗来源及其工作浓度，以简化操作，避免筛选过程中的背景干扰，减少工作量，提高工作效率，筛选周期短，适应于流式细胞术抗体的快速筛选。

技术领域

本发明属于流式抗体筛选领域，具体涉及一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)：是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球，细菌，小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞术具有速度快、精度高、准确性好等优点，是非常先进的细胞定量分析技术。该技术被广泛的应用于细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等多个领域，如细胞周期、细胞凋亡、细胞活力的检测，淋巴细胞亚群与疾病的关系研究，器官移植后的免疫学监测，肿瘤的特异性指标的检测，药物作用机制研究，筛选新药等等。随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，对抗体的流式细胞术的应用要求日趋增加。目前各大商业抗体公司开发抗体主要以wb，IF，IHC应用为主，而流式细胞仪操作繁琐，仪器维护昂贵，筛选通量限制的因素，极大限制了抗体流式应用的开发。

申请号为CN201810143471.6的专利公开了一种利用流式细胞分选筛选纳米抗体的方法，所述方法步骤包括：(1)收集被免疫靶抗原的骆驼科动物的外周血B淋巴细胞；(2)应用靶抗原通过流式细胞术分选所述B淋巴细胞为单细胞；(3)将分选好的单个B淋巴细胞直接进行逆转录反应生成cDNA；(4)以cDNA为模板，PCR扩增抗体重链序列并回收扩增产物；(5)以步骤(4)扩增产物为模板，PCR扩增抗体的CH1与CH2序列编码基因；(6)以步骤(5)扩增为阴性的步骤(4)扩增产物为模板，PCR扩增抗体的VHH片段编码基因；(7)将步骤(6)获得的VHH片段克隆入表达载体，并在宿主菌中表达所述VHH片段；(8)鉴定步骤(7)表达的纳米抗体，但是这种方法较为复杂，且需要建立库容高、多样性丰富的抗体文库，易造成噬菌体污染。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种筛选能应用于流式细胞术抗体的方法，包括以下步骤：

(1)抗原表达及纯化，所述抗原包括免疫抗原、筛选抗原、流式筛选抗原；所述抗原含有MATX的cDNA基因序列，所述cDNA的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

(2)小鼠免疫，筛选效价高的小鼠做细胞融合；

(3)预实验处理，获取通透处理的细胞，所述细胞可表达MATX-GFP-His蛋白；所述MATX-GFP-His蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

(4)细胞融合和筛选；

(5)亚克隆；

(6)抗体生产。

进一步的，所述步骤(1)的具体步骤为：

A、免疫抗原表达及纯化：将MATX的cDNA基因序列利用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切定向插入到E.coli pT7质粒中，得到免疫抗原表达载体质粒，将所述免疫抗原表达载体质粒转入大肠杆菌进行表达获得免疫抗原蛋白，并过镍柱纯化免疫抗原蛋白，所述免疫抗原载体质粒的N末端带His标签，所述免疫抗原载体质粒的碱基序列如序列表SEQ IDNO.3所示；