[发明专利]一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法

说明书

本发明公开了一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，通过以正硅酸乙酯、Fe₃O₄磁性纳米粒子为原料，先制备出表面包裹一层Fe₃O₄磁性纳米粒子的二氧化硅纳米粒，然后再在表面进行接枝改性，将核酸酶固定在表面，制的一种特殊的固定化核酸酶。相比于市面上常见的磁珠式核酸酶，利用这种固定化核酸酶澄清大肠杆菌裂解液，水解能力更强，水解后的大肠杆菌裂解液粘度大大降低，能够稳定性好，储存时间可达2年以上；活力高，反复使用活性扔保持较高水品。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法。

背景技术

在生物技术领域中，大肠杆菌重组蛋白表达系统以其遗传背景清楚，细胞繁殖快，产量高，易于发酵放大，价格低廉等优势成为最常用的重组蛋白表达系统。胞内表达的重组蛋白在大肠杆菌细胞裂解之后需要进行过滤澄清之后才可用于下一步的层析纯化。为了能够提取出某一种微生物或动植物组织细胞中的成分(DNA、蛋白质等)，往往需要对大肠杆菌的细胞先进行大量增殖，然后采用超声波破碎或化学破碎，使细胞破裂，细胞中的各种物质释放出来，形成细胞裂解液。

生物组织或菌体裂解后，由于大量的核酸释放出来，裂解液的粘度迅速升高，这是由于大量核酸悬浊在液体中导致的，给后期的膜过滤造成很大的负担，过滤效率严重降低，使过滤澄清变得极为困难。

核酸酶是一种能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，有些核酸酶只能作用于DNA，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA。

发明内容

将核酸酶加至裂解液中，能够一定程度降低裂解液的粘度，但是其效果并不十分理想。为了进一步降低大肠杆菌裂解液粘度，本发明在核酸酶的固定化上进行研究，采用一种具有较高稳定性的固定化核酸酶，将其用于大肠杆菌裂解液的水解澄清方法中，不仅有效降低了裂解液的粘度，其稳定性也大大增强，并能反复多次使用而活性降低程度极小。具体通过以下技术实现。

一种用于大肠杆菌裂解液澄清的方法，采用固定化核酸酶水解大肠杆菌裂解液中的核酸；

其中，所述固定化核酸酶的制备方法为：

A1、取正硅酸乙酯、蒸馏水和无水乙醇混匀，且体积比为1～2.5:1:1，得混合液Ⅰ；

A2、取Fe₃O₄磁性纳米粒子加至混合液Ⅰ中，加入质量分数为26％的氨水催化，在磁场中搅拌8～12h，得混合液Ⅱ；

A3、取混合液Ⅱ于磁力架上静置10min，过滤取滤渣用超纯水反复洗涤至洗涤液为中性，在40～60℃条件下真空干燥6～10h，得磁性二氧化硅纳米粒；

A4、取3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的乙醇溶液加至磁性二氧化硅纳米粒中，同时加入偶氮二异丁腈，反复搅拌2～4h，静置3～6h，得表面改性接枝处理的磁性二氧化硅纳米粒溶液，即溶液Ⅰ；

A5、在溶液Ⅰ中加入核酸酶，在37℃下超声波振荡反应10～15min，再过滤取沉淀物在45～55℃下烘干，冷却得固定化核酸酶。

上述固定化核酸酶中，通过在二氧化硅表面覆盖一层Fe₃O₄，然后在进行表面接枝改性的方式，使核酸酶在磁性二氧化硅纳米粒表面结合更稳定牢固，储存时间可达2年以上，在利用固定化核酸酶澄清裂解液后，回收的固定化核酸酶在再次使用是，酶的活性仍能保持较高水平，仅仅降低约1～3％，因此能够反复多次使用。

优选地，步骤A5中,所述超声波振荡的频率为20kHz～30kHz。

优选地，步骤A5中,烘干温度为45℃。