[发明专利]一种AchR的提取方法及基于此的EAMG小鼠模型构建方法

权利要求书

1.一种AchR的提取方法，其特征在于，所述方法是从黑斑双鳍电鳐剖取其电器官，匀浆破碎后离心，得到含AchR的上清液，然后用中华眼镜蛇毒制备神经毒素亲和层析柱，经分离纯化后得到AchR。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(1)从黑斑双鳍电鳐剖取其电器官,存于-80℃冰箱；

(2)将解冻的电器官与匀浆缓冲液倒入组织破碎机中，高速匀浆后得到均质混合物，离心弃上清液，将沉淀物与匀浆缓冲液混合并振荡过夜，将振荡后的混合物离心，得到含AchR的上清液；

(3)用中华眼镜蛇毒制备神经毒素凝胶柱；

(4)制备羟基磷灰石柱子；

(5)亲和纯化AchR蛋白：将神经毒素凝胶柱中的神经毒素凝胶与步骤(2)得到的AchR的上清液混合，振荡过夜，将振荡混合液重新装柱，制备AchR毒素亲和层析柱；用胆酸钠缓冲液冲洗AchR毒素亲和层析柱以及羟基磷灰石柱子；用氨甲酰胆碱缓冲液冲洗含有羟基磷灰石柱子；用塑料管连接AchR毒素亲和层析柱、羟基磷灰石柱子和Bio-Rad蛋白纯化系统的蠕动泵，运行蠕动泵；再用柱子冲洗液冲洗羟基磷灰石柱子，用洗脱缓冲液冲洗羟基磷灰石柱子，收集洗脱液，超滤管浓缩洗脱液，装入透析带，置于生理盐水中，4℃透析，得到纯化的AchR蛋白溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述冰冻的电器官与匀浆缓冲液的体积比为1:2；沉淀物与匀浆缓冲液的体积比为1:3；离心条件为：4℃，100000g×30min。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述神经毒素凝胶柱的制备过程为：将中华眼镜蛇毒毒素重悬于耦合液中，得到终浓度为5mg/mL的毒素溶液；将7.5g冻干的活化CNBr交联凝胶加入到1mmol/L的盐酸中，静置10—20min，倒入G3过滤器中，用1mmol/L的盐酸洗涤该凝胶后，再用耦合液洗涤一次；立即将凝胶与中华眼镜蛇毒毒素溶液混合，所述凝胶与中华眼镜蛇毒毒素的重量比为(25—35)：7.5，所述质量比的单位为mg/g，室温下摇荡，然后加入pH 8.0的0.2M甘氨酸，4℃过夜，依次用耦合缓冲液、0.1M且pH＝4的醋酸缓冲液、耦合缓冲液冲洗凝胶，以去除未偶联的神经毒素，将凝胶倒入Econo柱中，制备神经毒素凝胶柱。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述凝胶与1mmol/L的盐酸的质量体积比为(7—8)：(25—35)，所述质量体积比的单位为g/mL。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述耦合缓冲液、0.1M且pH＝4的醋酸缓冲液、0.5M氯化钠、耦合缓冲液冲洗凝胶的体积为凝胶体积的4—5倍。

7.基于权利要求1至6任一项所述方法的EAMG小鼠模型构建方法，其特征在于，所述方法是：取6—8周龄的C57BL6雌鼠，按每只小鼠注射免疫原的剂量：20μgAChR溶于100μlPBS，与100μlCFA完全乳化，得到共200μl乳剂，乳剂以50μl/只皮下注射四个部位，第一次免疫于双侧后足垫及双肩，第二、三次免疫于双大腿处及双肩，得到EAMG小鼠模型。