[发明专利]一种AchR的提取方法及基于此的EAMG小鼠模型构建方法

说明书

本发明公开了一种AchR的提取方法及基于此的EAMG小鼠模型构建方法。所述方法是从黑斑双鳍电鳐剖取其电器官，匀浆破碎后离心，得到含AchR的上清液，然后用中华眼镜蛇毒制备神经毒素亲和层析柱，经分离纯化后得到AchR。本发明首次从黑斑双鳍电鳐的电器官提取、纯化AchR蛋白成功诱导EAMG模型,为进一步研究重症肌无力创造了良好条件。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AchR的提取方法及基于此的EAMG小鼠模型构建方法。

背景技术

重症肌无力是一种由于神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜主要以乙酰胆碱受体(AchR)被自身抗体破坏，从而引发NMJ传递障碍而产生的自身免疫性疾病。目前公认的经典MG动物模型是用加利福尼亚电鳐(Torpedo california)电器官提取、纯化的AchR来主动免疫，建立EAMG模型,进行MG发病机制研究。由于加利福尼亚电鳐以及用于纯化的眼镜蛇神经毒素难以获得，国内目前难以建立符合国际化的临床前实验标准的EAMG动物模型。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种AchR的提取方法及基于此的EAMG小鼠模型构建方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述AchR的提取方法是从黑斑双鳍电鳐剖取其电器官，匀浆破碎后离心，得到含AchR的上清液，然后用中华眼镜蛇毒制备神经毒素亲和层析柱，经分离纯化后得到AchR。

所述AchR的提取方法具体包括如下步骤：

(1)从黑斑双鳍电鳐剖取其电器官,存于-80℃冰箱；

(2)将解冻的电器官与匀浆缓冲液倒入组织破碎机中，高速匀浆后得到均质混合物，离心弃上清液，将沉淀物与匀浆缓冲液混合并振荡过夜，将振荡后的混合物离心，得到含 AchR的上清液；

(3)用中华眼镜蛇毒制备神经毒素凝胶柱；

(4)制备羟基磷灰石柱子；

(1)亲和纯化AchR蛋白：将神经毒素琼脂糖柱中的神经毒素凝胶与步骤(2)得到的AchR的上清液混合，振荡过夜，将振荡混合液重新装柱，制备AchR毒素亲和层析柱；用胆酸钠缓冲液冲洗AchR毒素亲和层析柱以及羟基磷灰石柱子；用氨甲酰胆碱缓冲液冲洗含有羟基磷灰石柱子；用塑料管连接AchR毒素亲和层析柱、羟基磷灰石柱子和Bio-Rad 蛋白纯化系统的蠕动泵，运行蠕动泵；再用柱子冲洗液(10mM Tris base,1mM NaN₃，0.1％Triton X-100)冲洗羟基磷灰石柱子，用洗脱缓冲液(152mM pH7.5Sodium phosphate buffer, 1mMNaN₃，0.1％Triton X-100,Ph7.5)冲洗羟基磷灰石柱子，收集洗脱液，超滤管浓缩洗脱液，装入透析带，置于生理盐水中，4℃透析，得到纯化的AchR蛋白溶液。

(5)

其中，步骤(2)中所述冰冻的电器官与匀浆缓冲液的体积比为1:2；沉淀物与匀浆缓冲液的体积比为1:3；离心条件为：4℃，100000g×30min。

1、步骤(3)所述神经毒素凝胶柱的制备过程为：将30mg中华眼镜蛇毒毒素重悬于耦合液中，得到终浓度为5mg/mL的毒素溶液。将7.5g冻干的活化CNBr交联凝胶加入到1mmol/L的盐酸中，静置10—20min，倒入G3过滤器中，用750mL的1mmol/L的盐酸洗涤该凝胶后，再用耦合液洗涤一次；立即将凝胶与中华眼镜蛇毒毒素溶液混合，室温下摇 2h。加入pH8.0的0.2M甘氨酸，4℃过夜，依次用耦合缓冲液、0.1M且pH＝4的醋酸缓冲液、耦合缓冲液冲洗凝胶，以去除未偶联的神经毒素，将凝胶倒入Econo柱中，制备神经毒素凝胶柱。