[发明专利]用于靶向HBB RNA的gRNA及基于C2c2的HBB突变检测方法、检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于特异性靶向HBB RNA的gRNA，本发明还提供了一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)‑C2c2系统的人β珠蛋白基因(HBB)突变检测方法、检测试剂盒。本发明提供了检测方法，综合了gRNA靶向识别HBB基因转录产物RNA(靶标RNA序列)的优势以及当CRISPR‑C2c2复合物检测到靶标RNA序列时，复合物会切割带有检测标记的报告RNA，释放可检测信号的特点，将CRISPR‑C2c2系统应用在β珠蛋白基因(HBB)突变检测中，灵敏度高、准确度高，是一种具有巨大商业应用价值的检测方法及检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因检测及基因修饰领域，涉及一种用于特异性靶向HBB RNA的gRNA，及一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统的β殊蛋白基因(HBB)突变检测方法、检测试剂盒。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的获得性免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA或RNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。

CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9，Cpf1，C2c1等)来发挥功能。其中，Cas9，Cpf1，C2c1均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前，Cas9和Cpf1蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在且巨大的临床应用价值。

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR-Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。

CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。但是，CRISPR/Cas9的应用也有一些限制条件。首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。其次，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1，向导RNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。