[发明专利]一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

说明书

本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶及其应用。本发明通过蛋白质工程技术对野生型β‑葡萄糖苷酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种获得对胰蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶突变体。本发明所述的作用于纤维二糖和短链纤维寡糖的突变体β‑葡萄糖苷酶(mBGL1)，对胰蛋白酶的抗性比野生型BGL1提高2倍以上，半衰期延长，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

技术领域

本发明涉及β-葡萄糖苷酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21，简称BGL1)又称为葡萄糖苷水解酶，它能水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖，解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制，还可以把水果和茶叶中的香气前体物酶解，起到增强香气的作用。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，是纤维素酶系的重要组成成分之一。

β-葡萄糖苷酶在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。近年来，其在食品工业中表现出了重要的应用前景：β-葡萄糖苷酶可水解果蔬中的风味前体物质如单帖烯醇糖苷等，释放出具有浓郁天然香气的物质，已成为食品工业中重要的风味增香剂。在制备功能性食品时则用于生物活性物质的转化，如豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物,都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元。β-葡萄糖苷酶的另一重要用途是作用于纤维素生物转化，纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义。在饲料工业中,β-葡萄糖苷酶常被作为一种饲料添加剂,它可以酶解富含纤维的细胞壁,使细胞内包含的蛋白质等营养物质释放出来,同时又将纤维降解为便于动物消化吸收的还原糖,从而提高饲料利用率。但是在实际应用中还是有许多不足,如稳定性不够好等，这会影响β-葡萄糖苷酶的有效性而增加了应用成本。因此对葡萄糖苷酶进行改造具有十分重要的意义。

近十八年来，有关β-葡萄糖苷酶的专利有近190个，这些专利主要集中于发现和筛选来自不同来源的产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或通过基因重组方法获得产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株(如所产β-葡萄糖苷酶具有嗜/耐热(ZL201610060528.7、ZL201310049606.X、ZL201510203453.9、ZL201510203484.4、ZL201110214130.1)、高温中性(ZL201410713835.1)、中温中性(ZL201410717927.7、ZL201110334815.X)、嗜热碱性(ZL200510116748.9)、嗜热耐酸性(ZL200910218167.4、ZL201410753327.6、ZL201510460386.9)、酸性(ZL201410718610.5)、嗜温耐乙醇(ZL201010577713.6、ZL201410235451.3)、高表达(ZL201010170523.2、ZL201410037538.X、ZL201410037437.2、ZL201010565278.5)、耐高糖(ZL201210540712.3、ZL201210541293.5、ZL201710698739.8、ZL 201710366423.9、ZL201610095165.0、ZL201310224173.7、ZL201010248207.2)、耐糖耐酸(ZL201710839935.2)、高产耐糖耐酸(ZL201710839898.5)、耐高糖耐碱(ZL201410668699.9)、高产嗜温耐乙醇(ZL201110417104.9)、高活力(ZL201110102978.5)、高催化效率(ZL201610407183.8、ZL201610061066.0、ZL201610060603.X、ZL201610061593.1)、高耐受性(ZL201510175655.7)、持续高效分泌(ZL201310187648.X、ZL201510626711.4)等特征之一的菌株)，以及筛选产β-葡萄糖苷酶菌株的方法(ZL201510903621.5、ZL201210127162.2、ZL201710279045.0、ZL201410075528.5、ZL200710114837.9)，β-葡萄糖苷酶纯化方法(ZL200710043571.3)，β-葡萄糖苷酶酶活测定方法(ZL200910096109.9)，β-葡萄糖苷酶固定化方法(ZL201510920113.8、ZL201710579688.7、ZL201710689763.5、ZL201610348992.6、ZL201610899746.X、ZL201310712037.2、ZL201210449928.9、ZL201210052838.6、ZL201110293398.9、ZL200810035950.2、ZL201810109984.5)，β-葡萄糖苷酶制备方法(ZL201710581264.4、ZL201510026295.4、ZL201410510836.6、ZL201110374822.2、ZL200910153807.8、ZL200910092695.X、ZL201810034473.1)，构建产β-葡萄糖苷酶基因工程菌方法(ZL201410126924.6、ZL 201410699758.9、ZL201610285023.0、ZL201610838951.5、ZL201510172770.9、ZL201510658194.9、ZL201410801030.2、ZL201410801031.7、ZL201210017857.5、ZL201110221185.5、ZL201110301931.1、ZL201110034926.9、ZL201110132525.7、ZL201110266535.X、ZL200910092527.0、ZL200610025503.X、ZL201110120297.1、ZL200910029055.4、ZL200910159235.4)，及上述所得β-葡萄糖苷酶的编码基因和应用等。通过检索中国学位论文库发现近年来有关β-葡萄糖苷酶酶活性质的论文有很多，其中主要集中于通过基因重组、复合诱变、改良筛选方法、对发酵条件进行优化等方法来提高其酶活以及热稳定性(Q55 Q785、TQ925、TQ929.2、TQ925 TQ920.1、Q939.9、TS261.11、TQ925、TS201.25 TS201.3、Q814、Q814.1 Q936)、葡萄糖耐受性(Q949.327.103、Q556.2 Q786)催化效率提高(TQ925)、耐热、耐碱及耐部分金属离子的特点(Q93-331、S216.2、Q949.327.1Q943.2、TQ925.5、R282.71 Q556.2)等等。而具有胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶目前尚未见报道。