[发明专利]一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法

说明书

本发明公开了一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，包括以下步骤：配制以氯化钠作为溶质，TCM199作为溶剂配制成含有1wt％Nacl的液体，测量液体的渗透压，过滤，分装，加热至38.5℃备用；将卵泡液中的卵丘卵母细胞挑到盛有洗卵液的培养皿中，移入盛有400μL 1wt％Nacl液体的1.5mL离心管中，将离心管置涡旋振荡5分钟，再瞬时离心，转移到培养皿中；借助口吸管针将除去卵丘颗粒细胞的卵母细胞转移至TCM199操作液中，且快速清洗3遍，并置于盛有TCM199液滴中恢复5分钟，本发明通过1wt％Nacl处理去除猪未成熟卵母细胞外围卵丘细胞，具有省时、成本低、安全高效等优势。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体是一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法。

背景技术

随着动物胚胎工程生物技术的不断完善及广泛应用，极大地推动了畜牧业与生物医学等领域的快速发展。利用胚胎工程技术不仅可以改良家畜的品种、生产药用蛋白、制备人类疾病模型，还可以为动物胚胎发育机理的研究提供丰富的试验材料。由于猪在生理、解剖结构、卵母细胞成熟、胚胎发育时间等方面与人类有许多相似之处。因此在生物医学研究领域猪已被胚胎生物学家和遗传学家作为重要的模式动物。

目前，猪卵母细胞体外成熟是推动体外受精、体细胞克隆、胚胎移植等现代动物胚胎生物技术在畜牧业与生物医学中广泛应用的重要基础，而卵丘细胞在卵母细胞体外成熟及胚胎后续发育中发挥着非常重要的作用。研究发现卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用参与调控猪卵母细胞细胞核和细胞质成熟。因此，针对发现卵母细胞和卵丘细胞特异性表达的基因的研究，将卵母细胞及其周围致密的卵丘细胞独立分开是开展以上生物学研究的重要前提。所以，发明一种简单、经济、高效的去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法就显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种简单、经济、高效的去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，回收效率高且死亡率低，为今后开展关于猪卵母细胞与卵丘细胞相互作用的研究提供丰富的试验材料。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，包括以下步骤：

(1)溶液的配制：:配制以氯化钠作为溶质，TCM199作为溶剂配制成含有1wt％Nacl的液体；配制步骤(1)的液体前后分别测量液体的渗透压，再将上述所配制的液体进行过滤，分装到1.5mL离心管中，加热至38.5℃备用；

(2)卵丘卵母细胞复合体去除外围卵丘细胞：将卵泡液中的卵丘卵母细胞挑到盛有洗卵液的培养皿中；利用口吸管针将上述挑选出的卵丘卵母细胞移入到提前预热好盛有400μL 1wt％Nacl液体的1.5mL离心管中，将含有卵丘卵母细胞的离心管置于涡旋振荡器中涡旋振荡5分钟，用离心机将离心管进行瞬时离心，然后将涡旋震荡后带有卵母细胞的液体转移到培养皿中；借助口吸管针将除去卵丘颗粒细胞的卵母细胞转移至TCM199操作液中，且快速清洗3遍，并置于盛有TCM199液滴中恢复5分钟，从而完成去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的收集。

步骤(1)中，配制液体之前测量TCM199的渗透压值为300osm，配制之后的液体渗透压值为600osm。

步骤(2)中，洗卵液的制备方法为：用100mL去离子水溶解1g PVA，待PVA完全溶解，冷却后再取9.55g DPBS粉末，加去离子水，使溶解，定容至1L，高压前盖锡箔纸。高压结束后冷却，以1mL/L的比例加酚红和双抗。在超净台内，使用0.22μm滤器过滤，除菌后分装至50mL离心管中，4℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：