[发明专利]一种针对产苯唑西林酶OXA-48细菌的特异性检测方法

说明书

本发明涉及生化分析和耐药细菌检测技术领域，尤其涉及一种针对产苯唑西林酶OXA‑48细菌的特异性检测方法。本发明提供了利用等温滴定微量热仪记录碳青霉烯酶中D类苯唑西林酶OXA‑48在特定条件下催化碳青霉烯类底物时的实时热谱曲线，并根据该曲线是否具有“双相热谱曲线”特征，快速准确地判断待测细菌样品是否携带OXA‑48酶的信息，即待测细菌样品是否为产OXA‑48酶细菌。经实验证实，本检测方法具有良好的特异性和灵敏度，而且本方法操作简单快速，可在20分钟内准确获得样本检测结果，节省了检测时间，提高了检测效率。因此，本发明方法的推广应用可满足针对苯唑西林酶OXA‑48的医学研究及临床应用需要。

技术领域

本发明涉及生化分析和耐药细菌检测技术领域，尤其涉及一种针对产苯唑西林酶OXA-48细菌的特异性检测方法以及其在生物医学中的应用，具体涉及采用等温滴定微量热仪记录苯唑西林酶OXA-48在特定条件下催化碳青霉烯类底物时出现的“双相热谱曲线”特征，并根据该特征的出现与否快速判断待测样品是否产OXA-48酶的特异性分析方法。

背景技术

碳青霉烯类抗生素自1976年被发现以来，一直是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。然而，随着临床的大量使用，这类抗生素的疗效正在丧失，许多细菌已经能够通过产碳青霉烯酶水解碳青霉烯类抗生素而使其失活。

基于氨基酸序列相似性，碳青霉烯酶被分为两个超家族：以丝氨酸为活性中心的A和D类，以及活性中心需要金属离子辅助的B类。苯唑西林酶OXA-48是近年来发现的一种新的D类碳青霉烯酶，具有一定的碳青霉烯类药物水解活性，该酶在肠杆菌科中报道较多，其活性不能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，因此产此类酶的细菌几乎对所有β-内酰胺类抗生素耐药。另外，由于编码该酶的基因位于质粒等可移动遗传因子上，使得该类酶基因可在细菌间广泛传播，从而增大了耐药性蔓延的速度和范围。近期研究表明，产OXA-48细菌已经开始在我国传播，未来极有可能像产KPC和NDM细菌一样爆发流行，更为棘手的是，由于苯唑西林酶OXA-48往往呈现低水平耐药，不容易被美国临床和实验室标准协会推荐的Carba NP方法检出，严重影响了对携带OXA-48细菌的监测与防控。由此可见，开发新型、高特异性检测产OXA-48细菌的实验方法已迫在眉睫。

本发明人在前期研究中开发出了一种β-内酰胺类抗生素敏感性的快速检测方法，然而该方法是针对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类等各类β-内酰胺类抗生素的通用型检测方法，因此其选择性和特异性较低，只能提供待测样品对某类β-内酰胺类抗生素是否敏感的信息，而无法提供β-内酰胺酶的具体类别信息，因此其在科学研究及临床实践中的应用价值受到了削弱，另外，作为一种通用型检测方法，虽然它能够提供给我们一些有关β-内酰胺类抗生素耐药性和敏感性方面的有用信息，但其检测灵敏度仍有待提高，我们发现，该方法对耐药水平较低的β-内酰胺酶检测灵敏度及准确性并不理想。

综上，如何在上千种现有β-内酰胺酶中针对特定类别的β-内酰胺酶开发出特异性高的检测方法，为科研及临床提供准确可靠的参考信息，已成为本领域中一个亟待解决的问题，尤其是针对碳青霉烯酶中活性最低、最难检测的OXA-48酶，如何在提高其检测特异性的同时提高检测灵敏性也是一个严峻的挑战。目前为止，检测特异性和灵敏性均理想的OXA-48酶检测方法还少见报道。

发明内容

为了克服现有β-内酰胺类抗生素敏感性检测方法特异性和灵敏性不佳的缺陷，并为活性很低的OXA-48酶提供适宜的检测手段，本发明在反复实验的基础上，通过对各项检测条件进行筛选和优化，建立了一种新的针对产苯唑西林酶OXA-48细菌的高特异性检测方法，以满足医学研究及临床应用的需要。