[发明专利]一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法

说明书

本发明公开了以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法，包括如下步骤：胚胎准备；DAPI染核；制备凡士林柱支撑柱及添加抗淬灭剂：首先，用凡士林在载玻片一侧方形区域的四角点四个柱，且四个凡士林柱所围成的面积要小于盖玻片的面积；在四个凡士林柱围成区域内的正中央滴加15μL抗淬灭剂；压片、封片；激光共聚焦显微镜扫描成像；将制备凡士林柱为支撑的载玻片分别在激光共聚焦显微镜的普通光和紫外光激发下观察猪第七天囊胚的立体结构。本发明的以凡士林柱为支撑保持胚胎立体结构的荧光成像技术，通过降低胚胎立体荧光成像时耗材使用的成本而代替商业化耗材依赖的成像技术，使胚胎立体成像技术的应用更加广泛。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体是一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法。

背景技术

随着人类对未知科学更深入地探索，与之相应的生物学技术和仪器也不断地发展，从而变得更加精密化、专业化和先进化。在细胞显微成像发明中，由于普通光学显微镜的限制，从而激发人们对新的成像手段地积极探索和开发。激光共聚焦扫描技术是在20世纪80年代中期发展起来并得到广泛推广和应用的新技术。激光共聚焦扫描显微镜在传统光学显微镜基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。

间接免疫荧光染色技术与激光共聚焦扫描技术相结合可实现猪植入前胚胎中不同蛋白定位与表达的发明。通过对胚胎进行断层扫描，即所谓的“CT 扫描”，每扫描一层得到一张影像，将多层影像叠加得到三维立体结构，从而可分别检测到整个胚胎内各种完整的荧光信号，直接了解胚胎内各个蛋白的定位以及表达情况。目前，应用激光共聚焦扫描技术对胚胎三维立体成像时很大程度上依赖于商业化耗材(显微载玻片、垫片)的支持，即在显微载玻片上粘贴垫片，再向垫片的孔中加入20uL DPBS+0.3wt％PVP，将已经荧光标记的胚胎放入孔中，盖上盖玻片进行激光共聚焦扫描，就能利用不同波长分别检测同一胚胎的不同荧光信号。现已有商品化的显微载玻片和垫片价格比较昂贵。然而，间接免疫荧光联合激光共聚焦扫描在生物学实验中已经成为常用的高清成像技术，因此，这势必使实验的成本增加及预算增高。

一般商业化的显微载玻片和安全垫片经济成本比较高，不能在实验中普遍使用；同时货期比较长且存在购买困难的情况，会影响实验进度；此外，垫片保存时间过长会导致黏性下降或者垫片之间有互相粘黏不易分开，从而会影响荧光成像效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单经济的维持胚胎立体结构的荧光成像技术，用以解决目前间接免疫荧光染色技术联合激光共聚焦扫描技术应用于猪植入前胚胎成像中商品化试剂的成本高、购买货期长、垫片保存时间长易导致黏性下降以及长期保存使垫片之间不易分开等问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法，包括如下步骤：

(1)胚胎准备；

(2)DAPI染核；

(3)制备凡士林柱支撑柱及添加抗淬灭剂：首先，用凡士林在载玻片一侧方形区域的四角点四个柱，且四个凡士林柱所围成的面积要小于盖玻片的面积，所点的凡士林柱的高度为2㎜；然后，在四个凡士林柱围成区域内的正中央滴加15μL抗淬灭剂；

(4)压片、封片；

(5)激光共聚焦显微镜扫描成像；将制备凡士林柱为支撑的载玻片分别在激光共聚焦显微镜的普通光和紫外光激发下观察猪第七天囊胚的立体结构。

优选地，步骤(1)中，胚胎准备具体步骤如下：

①收集胚胎：本发明以猪第七天囊胚为实验对象，将第七天囊胚放入 DPBS+0.3wt％PVP液滴快洗三遍；

②再将第七天囊胚移入4％PFA液滴中室温条件下固定15-20分钟；