[发明专利]识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用

权利要求书

1.一株能够稳定分泌特异性识别猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为3H9，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.15793，保藏时间为2018年6月6日。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的能够特异性识别猪圆环病毒2型病毒样颗粒的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的所述的单克隆抗体在检测猪圆环病毒2型病毒样颗粒中的用途。

4.一种用于定性及定量检测PCV2病毒样颗粒的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体、兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔多克隆抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液、终止液、HRP偶联物稳定/稀释剂以及PCV2 VLPs标准品。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，用于猪圆环病毒2型病毒样颗粒检测时，按照以下步骤进行：

（1）权利要求2所述的单克隆抗体用包被液按照1:12800稀释，每孔100微升加入到ELISA板，4℃包被过夜；

（2）对包被好的ELISA板用洗涤液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；加入200微升/孔封闭液到ELISA板，37℃封闭2小时；

（3）用PBS调整PCV2 VLPs标准品浓度为600μg/ml，2倍比稀释后得到梯度的PCV2 VLPs标准品；

（4）取各稀释度的PCV2 VLPs标准品和待检测样品各100微升，分别加入封闭好的ELISA板，37℃孵育1小时；

（5）孵育完毕后ELISA板用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；

（6）兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体按照1:3200稀释，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小时；

（7）用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；HRP标记的羊抗兔多克隆抗体用HRP偶联物稳定/稀释剂按照1:10000稀释，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小时；

（8）抗体孵育完毕后ELISA板用洗涤液洗涤4次，每次5分钟；

（9）每孔加入显色液100微升，37℃反应10分钟，每孔加入50微升2M硫酸终止反应；

（10）将酶标仪设定检测波长为450nm，在10分钟内对ELISA板进行读数，测定吸光值；将标准品浓度对数值为横坐标（X轴），相应OD值为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线图，将待测样品的吸光值代入方程，计算蛋白质含量。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被液为50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6；所述的封闭液为含10g/L BSA的0.01M PBS溶液，pH 7.6；所述的稀释液为0.02MPBS缓冲液，pH7.0；所述的洗涤液为含有体积百分比浓度为0.5%Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH 7.6，使用时稀释10倍；所述的显色液为TMB显色液；所述的终止液为2M硫酸。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，标准曲线图的R2值应不低于0.9800。