[发明专利]识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用

说明书

本发明公开了一种识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用。其中，能够特异性识别猪圆环病毒2型病毒样颗粒的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.15793的杂交瘤细胞株分泌产生。通过间接免疫荧光实验鉴定所得到的单克隆抗体3H9的特异性，结果表明该单克隆抗体可以特异性识别PCV2病毒粒子，并且能够与PCV2 VLPs反应，而不与线性cap蛋白包被的ELISA板反应。因此，本发明建立了一种可以同时定性和定量分析PCV2 VLPs的简便方法，解决了PCV2 VLP粒子结构检测仪器昂贵，操作困难以及定量方法不能区分非特异性蛋白和破碎亚基的问题。

技术领域

本发明涉及一株识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，还涉及该单克隆抗体在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

在疫苗研发，生产的各个环节，如菌种鉴定培养、分离纯化、产品检测等各个环节均需要对疫苗有效成分进行定性和定量分析检测。在菌种培养发酵，蛋白纯化，疫苗配制过程对疫苗有效成分VLPs进行定量检测分析，快速准确地对疫苗进行分析表征，对于建立和优化分离纯化工艺，提高产品质量、降低生产成本，以及确保疫苗安全有效都具有重要的意义。与其他生物分子相比，VLP疫苗往往分子量更大 (分子量高达数百万甚至数千万)、结构更加复杂(多个亚基组装)、稳定性差，因此，选择合适的分析方法显得尤其重要，建立准确可靠的分析方法的难度也更大。

目前，对VLPs进行定性分析，鉴定VLPs结构及组装的完整性和正确性有多种方法，但是均需要特殊的仪器完成，在生产过程中操作比较困难。主要方法有如下几种：

圆二色光谱(CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法和主要研究手段之一，是研究蛋白质构象的一种比较快速、简单、较准确的方法。它可以在接近其生理状态的溶液状态下测定，对构象变化灵敏，已广泛应用于蛋白质的构象研究中。蛋白形成聚集体VLPs之后，构象通常会发生变化，其α-螺旋的比例下降，β- 折叠的比例增加。因此，在VLP疫苗的研究中，CD主要用于疫苗的二级结构分析、疫苗样品和标准品等的比对以及疫苗结构变化的表征分析。

透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)技术作为快速检测病毒的常用手段之一，在病毒检测中发挥着异常重要的作用。TEM的分辨率最小可以达到0.1nm，可以看到在光学显微镜下无法看清的亚显微结构或超微结构，它是迄今为止能够直接观察病毒和VLP疫苗颗粒具体形态的主要方法。

冷冻电镜及X光晶体衍射可以得到高分辨率的病毒粒子或VLP结构，分辨率远敢于透射电镜，是一种更精细的直接观察病毒和VLP颗粒具体形态的方法。

超速离心技术是VLP疫苗的检测中不可或缺的一种方法，主要包括差速离心法和密度梯度离心法。同时，超速离心也是一种小规模纯化VLP疫苗的有效方法，可以浓缩和纯化VLP疫苗，供后续分析和其它性能表征。分析型的超速离心技术还可以直接测定VLP疫苗的浮力密度和和沉降系数。

高效液相体积排阻色谱(High Performance Liquid Size ExclusionChromatography, HPSEC)主要用于VLP疫苗分子量、纯度和含量的测定。HPSEC通过标准VLP疫苗样品在分析柱上的保留体积，可以大致判断纯化样品的分子量。一般VLP疫苗的分子量与其亚基的分子量相差较大，通过HPSEC很容易的将完整的VLP与亚基分开，进而可以对纯化样品中疫苗颗粒的完整性进行快速的检测。同时HPSEC灵敏度高，能够达到微克级的检测，用不同浓度的标准样品建立浓度-峰面积(或峰高) 的标准曲线，可以实现对微量疫苗样品的快速、准确定量。