[发明专利]一种小型猪胰岛细胞体外培养方法

权利要求书

1.一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)配置细胞生长液，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第一添加剂；

2)配置细胞培养液，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第二添加剂；

3)取出装有小型猪胰岛细胞的冻存管，融化后放入装有所述细胞生长液的离心管中，并采用所述细胞生长液将冻存管清洗，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，再离心处理后弃去上清液，采用所述细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有所述细胞生长液的第一培养皿中培养；

4)更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第二培养皿进行培养；

5)再次更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第三培养皿进行培养；

步骤1)所述第一添加剂的制备包括以下步骤：

101)按照重量比2:1-1:2称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物1后，加入10-12倍混合物1重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；

102)将第一提取残渣加入6-8倍第一提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；

103)将第二提取残渣加入6-8倍第二提取残渣重量的去离子水，超声波提取15-45min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；

104)将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂；

步骤2)所述第二添加剂的制备方法为：

201)按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物2后，加入10-12倍混合物2重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；

202)将第四提取残渣加入6-8倍第四提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；

203)将第五提取残渣加入6-8倍第五提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；

204)将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂；

步骤1)中，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 8-10μM、胰岛素样生长因子12-15μg/L、血管内皮生长因子5-8μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β6-10μg/L、胰岛素12-15μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第一添加剂25-30μg/L；

步骤2)中，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 13-16μM、胰岛素样生长因子6-10μg/L、血管内皮生长因子2-4μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β12-15μg/L、胰岛素8-10μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第二添加剂18-20μg/L。

2.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 9μM、胰岛素样生长因子13μg/L、血管内皮生长因子6μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β8μg/L、胰岛素13μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第一添加剂28μg/L。