[发明专利]一种小型猪胰岛细胞体外培养方法

说明书

本发明公开了一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，该方法包括如下步骤：配置细胞生长液；配置细胞培养液；取出小型猪胰岛细胞冻存管，融化，放入装有细胞生长液的离心管中，离心处理，弃去上清液，采用细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有细胞生长液的第一培养皿中，放入培养箱中进行培养；培养后，更换培养皿和培养基，采用装有细胞培养液的第二培养皿进行培养，以后每1‑3天更换一次培养皿和培养基，且均采用细胞培养液作为培养基。本发明能够降低细胞凋零率，提高胰岛β细胞活力，且所培养的细胞有敏感葡萄糖刺激应答，能够满足研究人类胰岛疾病的要求，具有重要的市场价值和社会价值。

技术领域

本发明涉及动物细胞培养技术领域，具体涉及一种小型猪胰岛细胞体外培养方法。

背景技术

猪作为人类最早豢养的动物，其杂食性与人类相同，而与犬（肉食性）和猴（素食性）相差迥异。其生理功能、物质代谢方式、器官形态和疾病发生机制等与人类非常相似。猪与人类有着相似的细胞色素氧化酶P450系统，重要代谢酶学特征决定着药物在其体内的生物转化与人极为相似，是药物安全性评价及筛选、人类疾病的理想模型动物，尤其在抗肿瘤药物、心血管系统药物、皮肤渗透性药物、非甾体类抗生素、消化系统用药方面表现出明显优于犬和非人灵长类的优势。加之小型猪饲养成本低，操作简便，因此小型猪人类疾病模型应用于新药开发研究已成为国际范围内的焦点。

细胞增殖异常是许多重大疾病的病理基础,如细胞恶性增殖形成肿瘤、缺乏细胞新生导致某些退行性疾病等。在研发与细胞增殖异常相关疾病的新药中,新药候选物可以作用于基因、sRNA、代谢酶等靶点,但最终药效应当落在细胞增殖这个关键点。通过研究新药候选物对活体细胞的细胞增殖的药效，常是评价该新药候选物是否真实有效和安全的关键点。小型猪作为人类疾病模型的较佳选择，在研究人类胰岛疾病（如糖尿病）的过程中，进行小型猪胰岛细胞的体外培养是必要步骤。现有的小型猪胰岛细胞体外培养技术存在细胞凋亡率高、细胞活力低以及稳定性差的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，包括如下步骤：

1）配置细胞生长液，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第一添加剂；

2）配置细胞培养液，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第二添加剂；

3）取出装有小型猪胰岛细胞的冻存管，融化后放入装有所述细胞生长液的离心管中，并采用所述细胞生长液将冻存管清洗，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，再离心处理后弃去上清液，采用所述细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有所述细胞生长液的第一培养皿中培养；

4）更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第二培养皿进行培养；

5）再次更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第三培养皿进行培养。

优选的，步骤1）所述第一添加剂的制备包括以下步骤：

101）按照重量比1:1称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物1后，加入10-12倍混合物1重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；

102）将第一提取残渣加入6-8倍第一提取残渣重量的去离子水，超声波提取后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；