[发明专利]EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、制备方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、其制备方法及试剂盒。本发明提供的EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球，用于捕获非小细胞肺癌患者的外周血中的循环肿瘤细胞，该EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球连接有EGFR抗体、Vimentin抗体以及叶酸，因此能够对非小细胞肺癌患者的外周血中的CTC进行快速富集分离，能够解决现有技术中CellSearch因不能够捕获缺乏EpCAM蛋白的CTC或已经发生上皮间质转化的CTC而造成的大量检测假阴性问题，因而能够用于CTC的鉴定、分析并提高CTC鉴定的精确度，极具临床应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、其制备方法及试剂盒。

背景技术

癌症的晚期经常发生转移，肿瘤的转移而不是原发性肿瘤导致约90％的癌症死亡，使其成为了癌症治疗的核心焦点。肿瘤细胞可以从原发部位迁移到循环系统(例如，血液，淋巴液和脑脊髓液)然后扩散到其他器官。此时癌细胞亚群离开原发肿瘤，通过血液循环迁移并定植新的远端组织形成新的肿瘤块。因此，早期识别通过血液循环传播的癌细胞，即循环肿瘤细胞(CTC)，及时准确地检测稀有和极少数CTC，对于癌症治疗的成功和改善患者的生存率是至关重要的。循环肿瘤细胞(CTCs)的存在与预后不良密切相关。早期研究表明，基于CTC的治疗策略可能会影响癌症患者的临床结果，提高其生存率。

然而，血液中的CTC的丰度极低(每毫升血液10-100个)，检测CTC，特别是在转移的早期阶段检测CTC是一项挑战，从患者获得的1-7mL血液样本中识别和捕获极少数癌细胞存在一定的困难。

目前，商业上可用的用于识别来自癌症患者血液的CTC的技术较成熟的为CellSearch，其他各种捕获技术，包括免疫磁珠，阵列扫描，功能化微纳米结构表面，微流体混沌微混合器，活体流式细胞仪等也都正在发展与应用中。其中，基于免疫化学的珠子或纳米颗粒可以高效率和高选择性地识别和捕获全血中的CTC。CellSearch就是基于抗体包被的磁性纳米颗粒连接上皮细胞粘附分子(EpCAM)捕获CTC的技术。但是，CellSearch存在一定的局限性，例如不能够捕获缺乏EpCAM蛋白的CTC或已经已经发生上皮间质转化的CTC，因此造成后续的荧光鉴定CTC的准确性比较低，检测结果不可靠。

组织及细胞的固定一般采用一下方法：单纯固定液(1)4％中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。(2)乙醇固定液：使用时以80％-95％的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100％乙醇固定组织。(3)4％多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。混合固定液(1)乙醇-甲醛(乙醇-福尔马林，AF)固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定，该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。(2)B5(醋酸钠-升汞-甲醛)固定液：多用于固定淋巴组织，染色前应进行脱汞沉淀处理。(3)Bouin固定液：非常适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆，需现配现用。(4)Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非常适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。(5)Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高。