[发明专利]一种单分子蛋白的检测方法

权利要求书

1.一种单分子蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；

(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；

(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；

(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光素标记物为异硫氰酸荧光素、AMCA、Texas Red、TRITC、Rhodamine、R-PE、Cy3/5、DylightDyes或APC。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标记物为β-半乳糖苷酶，所述酶标记物对应的底物为二半乳糖苷；或所述酶标记物为辣根过氧化物酶，所述酶标记物对应的底物为鲁米诺。

4.根据权利要求1～3任一项中所述的检测方法，其特征在于，所述靶蛋白抗体偶联在磁珠上，加入标记物标记的检测抗体溶液混合孵育后去除磁珠；所述磁珠为纳米级Fe、Ni、Fe₃O₄或Fe₂O₃磁性微粒，磁珠粒径500nm-10μ m 。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，当标记物为荧光素标记物时，将靶蛋白与荧光素标记物标记的检测抗体复合物溶液作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成；当标记物为酶标记物时，靶蛋白与酶标记物标记的检测抗体复合物溶液与酶标记物的底物混合作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的液滴生成方法具体为将油相充满微流控芯片整个液滴存储腔；将水相通过压力泵从微流控芯片液滴形成通道输入芯片，水相在所述微流控芯片中的台阶结构处形成舌状流体，并在剪切力的作用下形成油包水微滴落入液滴存储部件内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，以多层状态铺满腔体。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分包括矿物油和烷烃，所述烷烃为12～16烷中的一种或其两者以上的混合物；所述表面活性剂包括EM90和Triton X-100。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上片、基片(6)、进样孔(4)和进样腔(10)；

所述上片设置有液滴形成流道(1)和液滴存储部件(2)；

所述液滴形成流道(1)与所述液滴存储部件(2)之间通过台阶结构(12)连接；

所述基片(6)与所述液滴存储部件(2)之间设置有液滴存储腔(8)；

所述基片(6)设置有凹槽(7)，所述凹槽(7)与所述液滴存储部件(2)紧密配合，形成液滴存储腔(8)；

所述进样孔(4)、所述进样腔(10)、所述液滴形成流道(1)、所述台阶结构(12)与所述液滴存储部件(2)依次连接。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，还包括进样部件(9)、排油流道(3)、排油腔(11)和排油孔(5)；

所述进样部件(9)包括进油端口(9.1)和储油端口(9.2)；

所述进油端口(9.1)、所述液滴存储部件(2)、所述排油流道(3)、所述排油腔(11)、所述排油孔(5)与所述储油端口(9.2)依次连接；

所述进样孔(4)、所述进样腔(10)设置于所述液滴存储部件(2)的一侧，所述排油腔(11)设置于所述液滴存储部件(2)的其余侧边的外周，所述排油孔(5)设置于所述液滴存储部件(2)的另一侧。