[发明专利]一种单分子蛋白的检测方法

说明书

本发明属于蛋白检测领域，公开了一种单分子蛋白的检测方法，待测蛋白与靶蛋白抗体混合生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物，与经标记物标记的检测抗体混合解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片或先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应然后将反应液分散于微流控芯片中；利用激光共聚焦检测系统进行荧光信号扫描，单分子计数。本发明所述检测方法可以快速对单分子蛋白进行定量检测，检测灵敏度高，适用于对表达丰度过低的蛋白。本发明所述检测方法操作方便，检测结果准确、CV值偏差小；而且通量高，可一次性检测多个样本。

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种单分子蛋白的检测方法。

背景技术

蛋白，作为机体最重要的组成成分，诠释着生命个体每一点的生长，发育和变化。从上世纪40年代开始，随着免疫组化等经典蛋白检测技术的发展，蛋白作为生物标志物的价值逐渐被人们所重视。尽管免疫组化，ELISA， Luminex等蛋白检测技术已经实现了数以千计的蛋白生物标志物检测，但蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢：年均仅有1-2个新的生物标志物进入实际的临床应用。据统计，在400,000多种已知的人类蛋白中，约有300,000种因为表达丰度过低而无法实现传统方法的检测。在现有技术可以检测的约100,000种蛋白中，大多数又无法在健康个体的样本中检测到，而仅仅出现在特定的疾病时期。大量蛋白生物标志物的重要功能，如同海平面下的冰山，无法被现有技术准确界定。不论临床还是基础研究，蛋白生物标志物的应用都拥有可观的发展前景，但现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展。

默克公司推出了单分子检测技术驱动的免疫检测平台，采用激光检测对每个单分子二抗上标记的荧光信号进行计数。其中的单分子检测技术(SingleMoleculeCounting,SMC^TM)能降低背景，并提高检测信号，MC^TM技术相较于传统免疫检测技术，信噪比有了很显著的改善，使得在一个系统里可以同时检测低表达和高表达的蛋白靶标，揭示疾病相关生物标志物的微小变化。SMC^TM技术的工作流程，在捕获和检测步骤，特异性抗体将每个生物标志物分子转化成信号。在洗脱步骤，荧光素标记的检测抗体从免疫复合物中解离下来。洗脱物被送入系统的毛细管，毛细管上有一个非常微小的检测空间可供激光照射。通过检测空间时，单个的荧光素标记抗体可以产生荧光闪烁，从而被检测到。峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号事件。由于激光的聚焦效应，会形成一个非常狭小的检测空间“爱里斑”，这个空间集中了多达84％的激光能量，能够最有效地照射和激发单个荧光分子。 SMC^TM单分子检测技术会依次检测通过“爱里斑”区域的单个荧光信号，峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号，并将检测到的数字信号进行汇总，显著地提高了检测灵敏度，可达pg/ml。但仍无法满足对表达丰度过低的蛋白进行检测的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的检测灵敏度低，无法满足对表达丰度过低的蛋白进行检测的要求的问题，提供一种单分子蛋白的检测方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种单分子蛋白的检测方法，包括以下步骤：

(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；

(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；

(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；

(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。