[发明专利]常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒

说明书

本发明公开了一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。本发明通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudo rabies virus，PRV)是引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要特征的病毒。伪狂犬病于1813年首次被报道出来，其病原于1910年被证明是病毒。PRV在分类学上属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、水疱病毒属成员，病毒粒子为椭圆形或圆形，二十面体立体对称。病毒基因组由长独特区(Unique longregion，UL)、短独特区(Unique short region，US)以及颠倒重复区(IRS)(位于US两侧的末端重复序列(Terminal repeat，TR)与内部重复序列(Internal repeat，IR)组成)。其基因组为线状双链DNA，大小约180kb，可编码70～100种蛋白或多肽。目前已有被发现并测序的11种糖蛋白：gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gL，gM，gN，gK，它们均为HSV-1的同源蛋白。gB、gD、gH、gL是体外复制所必需的糖蛋白基因，其余为非必需糖蛋白。gB作为病毒的重要囊膜蛋白，对于病毒的感染起到关键作用。伪狂犬病可引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎及怀孕母猪流产、死胎为主要症状的一种重要传染病。能引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病尤其是猪的伪狂犬病，已成为危害当今养猪业的最严重的传染病之一。因此，建立快速检测伪狂犬病病毒方法具有重大意义。

人们通过多种方法检测PRV，如血清学检测方法，分子生物学技术，限制性核酸内切酶分析等，其中分子生物学技术(核酸探针技术和聚合酶链式反应技术)具有特异性强、灵敏度高等优点越来越被人们重视和发展。与本发明相比，这些技术对精密设备高度依赖，尤其是荧光定量PCR仪，使其主要集中在中心实验室内使用，未能帮助医务人员真正在现场实现伪狂犬病病毒的快速检测。此外，由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量PCR难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。

综上，本发明针对现有伪狂犬病病毒病毒检测的缺陷及市场需求，开发出一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。本发明采用的常温恒温核酸扩增技术是利用荧光探针的高特异性结合重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA核酸扩增技术)的快速、高灵敏度和高通量等特点，建立一种快速检测PRV的方法。即在37℃恒温下，来自于大肠杆菌的recA重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。通常在30min内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。目前国内外应用RAA核酸扩增技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，例如登革病毒、肠道沙门氏菌、结核分支杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等等，该技术在伪狂犬病病毒检测方面尚未发现报道。因此本发明所提供的方法在伪狂犬病病毒检测领域具有一定的开拓性，可以为伪狂犬病的快速诊断和监测奠定坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物和探针。

本发明的另一目的在于提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂。

本发明的再一目的是提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒。

为了实现本发明的目的之一，本发明采取以下技术方案：