[发明专利]一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物及其应用

权利要求书

1.一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物，其特征在于：所述组合引物包括针对人类斑秃在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr6、chr9、chr10、chr11、chr12、chr14、chr16、chr18、chr19染色体上的ACOXL基因上的rs12986962和rs3789129位点，CLEC16A基因上的rs3862469位点，FAM19A2基因上的rs4348998位点，FPR2基因上的rs17834679位点，GSE1基因上的rs7500151位点，IL13基因上的rs848位点，IRF4基因上的rs6906608位点，LOC101928337基因上的rs12348691位点，LPP基因上的rs9864529位点，MAGI3基因上的rs17031716位点，PFKFB3基因上的rs631902位点，PLXNC1基因上的rs7299099位点，RP11基因上的rs2847266位点，SYT14基因上的rs170557位点，TNFRSF1A基因上的rs1860545位点以及基因间的rs10761660、rs1171582、rs2216164、rs247459、rs2781388、rs574087、rs6848139、rs7682481、rs9275524、rs972099位点；所述组合引物包含了所有所选位点的正向引物和反向引物，如chr2染色体上rs12986962位点的引物包含了正向引物序列SEQ IDNO:1和反向引物序列SEQ ID NO:2，其它位点的引物序列详见引物序列表。

2.权利要求1所述的组合引物在制备人类斑秃相关基因突变筛查试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的组合引物和一组包含饱和染料的PCR反应mix，所述组合引物的序列如SEQ ID NO:1-52所示。

4.权利要求3所述的试剂盒在人类斑秃相关基因突变筛查中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品采集、DNA提取和PCR扩增引物的设计：所述扩增引物设计为上述组合引物；

2)高分辨率溶解荧光定量PCR扩增上述组合引物：将步骤1)中不同的组合引物按照等比例混合，混合后作为一个的引物池，按照试剂盒要求配置反应体系，体系如下：

用此引物按照荧光定量PCR的方法进行扩增，扩增条件如下：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65-55℃退火10s，每个循环下降0.5℃，72℃延伸30s的程序进行45个循环；扩增出的DNA片段即为扩增文库；

3)步骤2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲线法进行高分辨率溶解曲线过程，扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s，从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集，25次/℃，最后，降温至40℃。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述组合引物为26对组合引物，所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度3度内，且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△G的绝对值小于5。