[发明专利]双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）靶磁珠制备：分别将捕捉磁珠与目标靶分子、消减靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分钟，洗涤缓冲液洗1次，形成磁珠-目标靶、磁珠-消减靶；再分别加入蛋白封闭液，37±0.3℃封闭1h小时后去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠；

（2）双向消减结合：将随机ssDNA库用结合缓冲液溶解，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却；

正向结合：第一轮消减结合：将随机寡核苷酸文库先和磁珠-消减靶复合物37℃结合1h，磁分离，吸出上清；将上清加入到磁珠-目标靶复合物中，37℃结合1h，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在磁珠中加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，上清为第一轮次级文库；从第二轮开始，将次级文库先与磁珠-目标靶复合物结合，磁分离弃上清，用0.5mL洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；在结合目标靶的磁珠中，加入结合缓冲液，95℃加热5min，重复3次，混合吸出的上清，加入磁珠-消减靶复合物中，37℃结合1h，磁分离，吸出上清为次级文库；

反向结合：将磁珠-消减靶复合物视为目标靶，磁珠-目标靶复合物为消减靶进行结合，结合过程同正向结合；

（3）洗涤：用洗涤缓冲液充分摇动，洗涤3次，去除未结合的非特异性分子；

（4）洗脱：加入洗脱缓冲液洗结合有靶分子的磁珠3次后，磁分离，在磁珠中加入1×PCRBuffer，95℃加热 5分钟，磁分离，吸取上清，重复加热 3次，收集上清混匀；

（5）次级文库的制备：实时荧光定量-PCR对前轮筛选消减获得的ssDNA进行富集检测后，用不对称PCR方法和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶制备次级文库：以步骤（1）所述次级文库上清为模板DNA，PCR扩增16~20个循环后，得到第一轮筛选产物；再以筛选产物为模板，不对称PCR扩增20~30个循环，取PCR产物进行变性PAGE凝胶电泳，切取单链条带，粉碎，加入洗脱缓冲液 300μL，95℃加热5min，3000r/min离心收集上清，重复3次；将上清加入3000Dr超滤管中，超滤20min，得到ssDNA次级文库；

（6）循环筛选：重复步骤（1）-（5），筛选7~15轮，每轮用实时定量-PCR检测次级库对目标靶和消减靶的结合量，确定富集程度，制备适配体富集文库；

（7）对适配体富集文库进行高通量测序。

2.如权利要求1所述一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述目标靶分子为单一分子、多种分子混合物、以及血清、细胞、组织、细菌和病毒裂解悬液中的一种；所述消减靶分子为：在靶分子混合物中，除靶分子外需要消除的分子。

3.如权利要求1所述一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述捕捉磁珠特征在于：所述捕捉磁珠的结构是由琼脂包裹顺磁磁铁，在琼脂外有环氧基、羧基、NHS磁珠、链霉亲合素、核酸适配体、抗体中的一种，可有效的偶联靶分子，或靶分子混合物的磁珠。

4.如权利要求1所述一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述蛋白封闭液为pH=7.4的0.01M PBS，其中含2%蔗糖、1％BSA、1%酪蛋白，0.5%叠氮钠，4℃保存。

5.如权利要求1所述一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述随机寡核苷酸ssDNA库中，每个分子序列长为80-150个碱基，其两端是固定引物，中间有25-60个随机核酸序列，并由10^12-14个分子组成。

6.如权利要求1所述一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述结合缓冲液为pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液。