[发明专利]双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种双向热循环消减SELEX快速筛选方法及试剂盒，该方法将纳米（琼脂）磁珠材料、SELEX技术和高通量核酸测序有机结合，建立针对（复合）靶标分子的快速高效核酸适配体筛选技术体系及相应试剂盒。该试剂盒可快速筛选出特异性强、亲和力高的核酸适配体。该方法具有快速、高效、成本低、操作简单、可机械化完成等优点。

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体的筛选方法，尤其是涉及一种将纳米磁珠材料、SELEX技术和高通量核酸测序有机结合，建立双向热循环消减SELEX快速筛选（复合）靶分子核酸适配体的方法；本发明同时还涉及一种双向热循环消减SELEX快速筛选（复合）靶分子核酸适配体的试剂盒。

背景技术

SELEX技术，即指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolution of Ligandsby Exponential Enrichment，SELEX），利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体（Aptamer）。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过二十多年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具，被应用于生物化学、基因调控、疾病诊断及新药研发等领域。随着筛选的靶标越来越广泛，从最开始的有机染料和酶逐渐扩展到更小的离子、氨基酸、毒素以及更复杂的癌细胞、干细胞、临床组织切片、血清等，对于不同的靶物质，有必要采用适当的方法，才可以更快更方便地找到亲和力高、特异性强的适配体。

近年来，研究者在原有筛选方法的基础上将石墨烯，碳纳米管，毛细管，流式细胞仪，原子力显微镜等不同的材料和仪器引入了分离步骤以提高分离效率，使经典的SELEX技术得到发展和完善，衍生出了众多改良的SELEX技术如：反向筛选（counter SELEX）、消减筛选（subtractive SELEX）、毛细管电泳筛选（CE SELEX）、基因组SELEX（genomic SELEX）、加尾筛选（tailored SELEX）、切换筛选（toggle SELEX）和基于修饰核苷酸的SELEX等。这些方法的建立，提高了筛选效率，丰富了核酸适配体的应用形式，为核酸适配体的研究和应用奠定了基础。但是，这些筛选方法都存在一定的局限性，如筛选成本高、周期长、操作复杂，针对的靶标单一等。因此建立一种成本较低、操作简单、快速、高效的核酸适配体筛选技术具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，可用于血清、细胞、组织、细菌和病毒等样品的筛选。

一、双向热循环消减SELEX快速筛选方法

本发明双向热循环消减SELEX快速筛选核酸适配体的方法，包括以下步骤：

（1）靶磁珠制备：分别将捕捉磁珠与目标靶分子、消减靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分钟，洗涤缓冲液洗1次，形成磁珠-目标靶、磁珠-消减靶；再分别加入蛋白封闭液，37±0.3℃封闭1h小时后去上清，用洗涤缓冲液洗至无泡沫，分离磁珠中加入pH值为7.4的1×Binding buffer缓冲液，含0.1%的叠氮钠。

所述目标靶分子为单一分子、多种分子混合物、以及血清、细胞、组织、细菌和病毒裂解悬液中的一种；所述消减靶分子为靶分子中重复需要消除的对应分子。

所述琼脂磁珠，其结构是由琼脂包裹顺磁磁铁（四氧化铁）周围，经脱脂奶粉封闭，外加活性基团，如羧基、环氧基、氨基等活性基团，具有很好的结合生物分子的能力。琼脂磁珠通过化学键与蛋白质等生物分子结合，并通过结合的生物分子与其他分子发生酶催化、免疫、配体配基等反应，并且与核酸的非特异性吸附少。琼脂磁珠微粒的制备如下：