[发明专利]一种制备脱细胞生物组织材料的方法

说明书

本发明属于生物组织材料的技术领域，具体涉及一种制备脱细胞生物组织材料的方法。所述方法包括如下步骤：包括冻融处理、超高压处理和去核酸三道工序，其中超高压处理采用的压力为400‑600MPa。与现有技术相比，本发明提供的技术方案采用反复冻融与超高压结合的方法，可明显缩短工艺耗时，提高脱细胞效率，另外实验参数更温和，减少了对生物支架结构的破坏；本发明实施例中超高压处理采用的压力不会导致介质水出现临界冰现象，可以更好的保留组织结构的完整性和机械性能。

技术领域

本发明属于生物组织材料的技术领域，具体涉及一种制备脱细胞生物组织材料的方法。

背景技术

由于脱细胞生物组织材料具有低免疫源性、完整的纤维结构和良好的机械强度，因而在医疗器械领域得到了越来越多的关注和应用。

目前，常用的脱细胞方法主要有物理法、酶消化法、酸碱法及化学去垢剂法等。然而，大量研究表明，以上几种方法存在很多问题：(1)物理法脱细胞效果较差，易导致细胞和DNA残留，引起机体免疫反应；(2)酶消化法对酶的浓度要求较高，高浓度的酶易导致胶原纤维组织受损，低浓度的酶则难以去除深层细胞，脱细胞效果差；(3)酸碱法中强酸强碱的环境对组织结构破坏较大；(4)化学去垢剂法不仅易破坏生物组织的胶原蛋白结构，残留的化学去垢剂还容易导致细胞毒性，且漂洗耗时长。因此，开发一种更简便、高效、安全的脱细胞方法将具有广泛的应用前景和重要的实用价值。

2006年，上海交通大学医学院上海儿童医学中心的殷猛等首次报道了在生物材料制备领域采用超高压技术进行脱细胞操作。首先将组织置入浸满MillliQ水的塑料袋中，在超高压设备中逐步加压至约980MPa，持续10分钟，再相继用酶消化法冲洗，酒精浸泡，PBS冲洗，共耗时11天。这种超高压脱细胞方法虽然可以完全去除细胞成分，简便快速，但是该方法中使用的压力较大，对设备要求高，且制备周期较长。另外，有研究表明高压会导致蛋白质变性，因此接近1000MPa的超高压对基质结构的作用还需进一步研究。同时，当压力高于600MPa时，作为传压介质的水会出现临界冰现象，进而会对胶原纤维造成损伤。

专利CN101185770描述了一种多次逐步增压的超高压脱细胞方法。将生物组织连通真空包装袋放入传压介质中，分别经过600MPa，800MPa和1000MPa各5分钟的超高压处理后，即可将细胞完全去除，且不破坏蛋白结构。但该过程中多次的逐步增压工艺较为复杂，对技术要求高；且后续压力较大，对设备要求高。同时，该过程中操作压力也均在600MPa及以上，也会出现水的临界冰现象。另外，超高压力也会导致组织结构致密性高，孔隙率小，很可能导致脱细胞效果降低。

总之，现有的生物组织脱细胞方法(如物理法、化学去垢剂法等)存在脱细胞不完全、胶原组织受损或残余物毒性较大等缺点，在工艺上还有待改善和提高。新的超高压脱细胞的处理工艺虽然有一定的优势，但是在压力设备需求、生物组织形态变化及机械性能强化等方面仍需进一步改进。

发明内容

本发明提供了一种制备脱细胞生物组织材料的方法，用以解决目前方法制备脱细胞生物组织材料脱除细胞不完全、组织受损严重或残留毒性物质的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述制备脱细胞生物组织材料的方法，包括冻融处理、超高压处理和去核酸三道工序，其中超高压处理采用的压力为400-600MPa。

可选地，所述方法具体包括如下步骤：

步骤一，将生物组织上的脂肪剥离并对所述生物组织进行修剪和清洗；

步骤二，冻融处理：将步骤一处理后的生物组织反复冻融多次；

步骤三，超高压处理：将步骤二处理后的生物组织清洗密封，置于超高压仪器内进行超高压处理；

步骤四，去核酸：将步骤三处理后的生物组织，用核酸酶去除细胞残余核酸组分；