[发明专利]核苷酸组合物、试剂盒及检测方法

说明书

本申请公开了一种核苷酸组合物和包含该核苷酸的试剂盒及检测方法。当待测样品中包含待测目标分子时，利用本发明设计的组合物二和引物对通过非对称PCR反应，可获得大量单链产物，这些单链产物可与利用本发明设计的组合物一制备好的银纳米簇探针杂交结合后会发出荧光，从而实现待测目标分子的可视性检测，本发明克服传统方法依赖于仪器判别的缺点，建立一种不依赖于复杂仪器的可视化、可定性定量的检测新方法，丰富了现有检测技术和方法，为以后银纳米簇在转基因方面的应用提供了思路和技术基础。在一个具体的实施方式中，本发明建立的组合物和方法的灵敏度达到0.5ng/μL且重复性好、特异性高。

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种核苷酸组合物、包含该核苷酸组合物的试剂盒及检测方法。

背景技术

我国于2002年7月开始实施《转基因食品卫生管理条例》，对转基因食品产品进行标识管理。目前国际上常用的转基因产品检测方法主要有酶联免疫检测(ELISA)、PCR-电泳检测、荧光定量PCR检测等技术，但这些技术对于大量转基因品系的检测数，往往需要专业的仪器，成本较高，且数据需要进行分析后才能得出结果。因此对于转基因作物的可视性检测技术进入人们的视野。邓婷婷等均有采取过可视化芯片法对转基因玉米Mir162进行检测，检测限可达0.01％；成晓维对转基因大豆、玉米和水稻中的转基因成分进行检测，灵敏度达0.1％。但由于基因芯片技术操作较为复杂，在PCR反应过程后，仍需要清洗、封闭、显色等步骤才能判别结果，繁琐的步骤限制了这些方法在实验室的常规应用。

金属纳米簇(NCs)在过去十年中发展非常快的纳米材料。其特点是在不大于2nm的尺寸内包含最多几百个分子，并由此展现出类似于分子的特征。并且由于自身尺寸、氧化态、结构和表面基团的性质，使得金属纳米簇具备展现出较强的荧光性质。而相比于金纳米簇，银纳米簇拥有可以在水溶液中表现出更强的荧光的特点，引起了广泛的研究。

发明内容

本发明提供了一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；组合物二的序列的杂交互补序列可与组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；组合物还包括一引物对，引物对包括引物1和引物2，引物1与组合物二连接；引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

进一步的，银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。

引物1与引物2的摩尔比在1:30以下。组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。

优选的，银纳米簇成核序列为序列表中SEQ ID№：7所示核苷酸序列；银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQ ID№：4所示核苷酸序列；识别序列为序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列；引物1与引物2的摩尔比为1:60。

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述核苷酸组合物和银纳米离子。

本发明还提供一种检测方法，该方法包括：

利用组合物一制备银纳米簇探针；

利用靶标序列、组合物二和引物对进行非对称PCR反应；

非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合。