[发明专利]一种提高毕赤酵母分泌表达的载体的构建方法

权利要求书

1.一种提高毕赤酵母分泌表达的载体的构建方法，其特征在于：该方法利用天然人I型胶原蛋白信号肽，替换毕赤酵母表达载体pPIC9K的酿酒酵母α-交配因子信号肽的Pre肽序列获得；

该方法由下述步骤组成：

(1)pPIC9K原始载体的点突变

根据毕赤酵母pPIC9K原始载体序列，选取其5435bp-6037bp DNA序列，将其中5709bp处的C突变为A；

(2)提高毕赤酵母分泌表达载体的构建

①设计合成引物

根据天然人I型胶原蛋白信号肽的核苷酸序列和酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，以天然人I型胶原蛋白信号肽替换酿酒酵母α-交配因子信号肽的Pre肽为目的，设计合成引物，引物序列如下：

上游引物COL1P-BF：5'-TATGGATCCAAACGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGGCTCCTGCTCCTCTTAGCGGCCACCGCCCTCCTGACGCACGGCGCTCCAGTCAACACTACAAC-3'；

下游引物αMF-XR：5'-GCGCTCGAGAGATACCCCTTCTTCTTTAGCAGCAATGC-3'；

②信号肽的替换

以毕赤酵母pPIC9K原始载体为模板，以上述引物进行PCR扩增，获得的基因片段与步骤(1)中Xho I酶切位点点突变的pPIC9K载体进行BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经纯化回收后，利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得信号肽改造后表达载体pPIC9K-COL1P。