[发明专利]一种提高毕赤酵母分泌表达的载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法，该方法利用天然人I型胶原蛋白信号肽，替换毕赤酵母表达载体pPIC9K的酿酒酵母α‑交配因子信号肽的Pre肽序列，获得表达载体pPIC9K‑COL1P，该表达载体实现了人溶菌酶的高分泌表达，但不局限于人溶菌酶一种蛋白。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法。

背景技术

随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术开发重组蛋白已越来越受到人们的青睐。毕赤酵母(P.pastoris)作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。毕赤酵母表达系统既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统以其独特的优势和潜力已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。

外源蛋白在毕赤酵母系统中的分泌机制是多样的，其中信号肽引导蛋白质的分泌是蛋白质释放的主要方式之一，信号肽(signal peptide)是存在于分泌蛋白质N末端的特异氨基酸序列，引导新合成的分泌性蛋白质至不同的转运系统。迄今在毕赤酵母成功实现外源蛋白分泌表达的信号肽主要类型包括酿酒酵母α-交配因子(α-MF)信号肽、酿酒酵母转化酶信号肽(SUC2)、毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽(PHO1)以及一些蛋白自身信号肽等，不同信号肽对毕赤酵母表达分泌外源蛋白有不同影响，而α-MF信号肽在毕赤酵母表达中应用最为成功。α-MF信号肽源自于酿酒酵母α交配因子N端85氨基酸序列，包括N端19氨基酸信号肽(Pre肽)和3个天冬氨酸连接糖基化的65肽(Pro肽)。α-MF信号肽虽然应用最为广泛，但也存在着一些不足之处，部分蛋白以α-MF为信号肽引导表达时无法获得表达或高表达，因此，研究不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法。

本发明所提供的提高毕赤酵母分泌表达载体是通过利用天然人I型胶原蛋白信号肽替换毕赤酵母表达载体pPIC9K中酿酒酵母α-交配因子(α-MF)信号肽的Pre肽序列来实现，具体方法如下：

1、pPIC9K原始载体的点突变

pPIC9K原始载体中含有两个Xho I酶切位点，分别在1192bp和5709bp位置，为了便于后期信号肽改造及外源基因的插入，将5709bp处Xho I酶切位点进行点突变。

2、提高毕赤酵母分泌表达载体的构建

(1)设计合成引物

根据天然人I型胶原蛋白信号肽的核苷酸序列和酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，以天然人I型胶原蛋白信号肽替换酿酒酵母α-交配因子信号肽的Pre肽为目的，设计合成引物，引物序列如下：

上游引物COL1P-BF：5'-TATGGATCCAAACGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGGCTCCTGCTCCTCTTAGCGGCCACCGCCCTCCTGACGCACGGCGCTCCAGTCAACACTACAAC-3'

下游引物αMF-XR：5'-GCGCTCGAGAGATACCCCTTCTTCTTTAGCAGCAATGC-3'

(2)信号肽的替换

以毕赤酵母pPIC9K原始载体为模板，以上述引物进行PCR扩增，获得的基因片段与步骤1中Xho I酶切位点点突变的pPIC9K载体进行BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经纯化回收后，利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得信号肽改造后表达载体pPIC9K-COL1P。