[发明专利]蛋白质的修饰与分离纯化以及巯基蛋白酶的酶活调控方法

权利要求书

1.一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，包括蛋白质的修饰以及修饰后的蛋白质的分离纯化，其特征在于：所述蛋白质的修饰是在蛋白质的巯基上偶联NIPAM聚合物，得到蛋白-NIPAM聚合物；

所述蛋白质的分离纯化方法为：将含有蛋白-NIPAM聚合物和其它物质的混合溶液加热至32℃以上，使得蛋白-NIPAM聚合物从混合溶液中析出，离心收集沉淀，得到纯的蛋白-NIPAM聚合物，最后用硫醇类还原剂处理蛋白-NIPAM聚合物，然后透析，得到纯化的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，其特征在于：所述蛋白质的修饰方法包括以下步骤：

1）将蛋白质和硫醇类还原剂分别溶解于醋酸缓冲液中，分别连接氮气除氧装置除氧7-10min，分别得到蛋白溶液和硫醇类还原剂溶液；将硫醇类还原剂溶液缓慢滴加到蛋白溶液中，在氮气除氧条件下磁力搅拌反应7-10min，反应后将混合液移入透析袋，透析袋置入缓冲液中透析三次，第一次透析使用醋酸缓冲液，后两次透析使用磷酸盐缓冲液，整个透析过程连接氮气除氧装置，透析结束后收集透析袋内的液体即透析液A；

2）调节透析液A的pH值至不小于8.0，将引发剂双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物溶液缓慢逐滴加入透析液A中，磁力搅拌反应30-35min，将反应后的混合液转移到透析袋中，采用磷酸缓冲液透析三次，每次透析分别加入终浓度为7.7%、3.85%、1%的二甲亚砜到磷酸缓冲液中，透析结束后，用0.22 μm的过滤器过滤透析袋内的液体，得到透析液B；

3）取5 mL透析液B移入圆底烧瓶A中并连接氮气除氧装置除氧至少23min；

取6 mg CuCl₂， 10 mL 纯水， 5 mL 甲醇， 7μL PMDETA和600mg NIPAM单体加入到圆底烧瓶B中，氮气除氧25min后加入7 mg抗坏血酸再除氧20min，以上操作在避光条件下进行；将圆底烧瓶B中的反应体系用氮气压入圆底烧瓶A中并保持氮气除氧反应30min，反应结束后将混合物移入透析袋并在磷酸盐缓冲液中透析三次，透析结束后，用0.22 μm的过滤器过滤透析袋内的液体，得到修饰后的蛋白质，即蛋白-NIPAM聚合物。

3.根据权利要求2所述的一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，其特征在于：所述硫醇类还原剂为TCEP。

4.根据权利要求1所述的一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，其特征在于：所述修饰后的蛋白质的分离纯化包括以下步骤：

1）将蛋白-NIPAM聚合物在不低于32℃的温度下水浴3-4min，然后11000rpm离心并重悬，重复三次以上，获得纯的蛋白-NIPAM聚合物；

2）在上述蛋白-NIPAM聚合物中加入硫醇类还原剂，处理10-15min,，反应液用缓冲液透析三次得到纯化的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，其特征在于：所述硫醇类还原剂为DTT。

6.一种巯基蛋白酶的酶活调控方法，其特征在于：其包括巯基蛋白酶的酶活抑制方法和巯基蛋白酶的酶活恢复方法;

所述巯基蛋白酶的酶活抑制方法为：在巯基蛋白酶的巯基上偶联NIPAM聚合物，得到巯基蛋白酶-NIPAM聚合物，所述巯基蛋白酶-NIPAM聚合物使得巯基蛋白酶的巯基被NIPAM聚合物所封闭，从而抑制酶活；

所述巯基蛋白酶的酶活恢复方法为：将含有巯基蛋白酶-NIPAM聚合物的混合溶液加热至32℃以上，使得巯基蛋白酶-NIPAM聚合物从混合溶液中析出，离心收集沉淀，将沉淀溶解于PBS中以去除杂质，得到巯基蛋白酶-NIPAM聚合物溶液，最后用硫醇类还原剂处理巯基蛋白酶-NIPAM聚合物溶液，然后透析，得到恢复酶活的巯基蛋白酶。

7.根据权利要求6所述的一种巯基蛋白酶的酶活调控方法，其特征在于：所述巯基蛋白酶为木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。