[发明专利]蛋白质的修饰与分离纯化以及巯基蛋白酶的酶活调控方法

说明书

本发明公开了一种蛋白质的修饰与分离纯化以及巯基蛋白酶的酶活调控方法，在蛋白质巯基上接上聚合物高分子，利用聚合物NIPAM在32℃的临界温度特性，在温度超过32℃时蛋白‑聚合物从溶液中析出，此时再将蛋白‑聚合物离心沉淀下来，将纯净的蛋白‑聚合物用DTT或其他硫醇类还原剂处理，断掉高分子以得到原蛋白，达到纯化目的蛋白的目的。巯基蛋白酶的表面裸露巯基与其酶活性密切相关，表面巯基被破坏后其酶活性也会丧失，当所述蛋白质为巯基蛋白酶是，该方法可以实现对酶活力的调控。

技术领域

本发明公开了一种蛋白质的修饰与分离纯化以及巯基蛋白酶的酶活调控方法。

背景技术

目前，蛋白质的分离纯化方法有很多种：（1）根据分子大小不同进行分离纯化，可分为透析、超滤、离心和凝胶过滤；（2）根据溶解度不同进行分离纯化，常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等；（3）根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法，有电泳和离子交换层析两类。上述分离方法或操作繁琐或分离不彻底，有些还需要几种分离方法结合使用。

蛋白质尤其是蛋白酶在各种环境变化中如温度变化、pH变化、紫外照射等条件下容易失去活力，所以酶活力的保护是一项非常重要的课题。目前对蛋白酶活力的保护方案主要是封闭酶活力中心的关键基团。巯基蛋白酶的酶活力就由其表面巯基控制，一些环境的变化导致巯基破坏、断裂、氧化等就会导致巯基蛋白酶丧失酶活力。目前保护巯基蛋白酶酶活力的方法主要是添加一些还原剂如半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦等保护其巯基不受氧化损害。这些方法需要一直添加试剂维持蛋白酶的巯基不受氧化损害，耗费成本较高且操作麻烦。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种蛋白质的修饰与分离纯化，在蛋白质巯基上接上聚合物高分子，利用聚合物NIPAM在32℃的临界温度特性，在温度超过32℃时蛋白-聚合物从溶液中析出，此时再将蛋白-聚合物离心沉淀下来，将纯净的蛋白-聚合物用DTT或其他硫醇类还原剂处理，断掉高分子以得到原蛋白，达到纯化目的蛋白的目的。

一种含巯基蛋白质的修饰与分离纯化方法，包括蛋白质的修饰以及修饰后的蛋白质的分离纯化，所述蛋白质的修饰是在蛋白质的巯基上偶联NIPAM聚合物，得到蛋白-NIPAM聚合物；所述蛋白质的分离纯化方法为：将含有蛋白-NIPAM聚合物和其它物质的混合溶液加热至32℃以上，使得蛋白-NIPAM聚合物从混合溶液中析出，离心收集沉淀，得到纯的蛋白-NIPAM聚合物，最后用硫醇类还原剂处理蛋白-NIPAM聚合物，然后透析，得到纯化的蛋白质。

具体的，所述蛋白质的修饰方法包括以下步骤：

1）将蛋白质和硫醇类还原剂（比如TCEP）分别溶解于醋酸缓冲液中，分别连接氮气除氧装置除氧7-10min，分别得到蛋白溶液和硫醇类还原剂溶液；将硫醇类还原剂溶液缓慢滴加到蛋白溶液中，在氮气除氧条件下磁力搅拌反应7-10min，反应后将混合液移入透析袋，透析袋置入缓冲液中透析三次，第一次透析使用醋酸缓冲液，后两次透析使用磷酸盐缓冲液，整个透析过程连接氮气除氧装置，透析结束后收集透析袋内的液体即透析液A；

2）调节透析液A的pH值至不小于8.0，将引发剂双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物(Bis[2-(2′-bromoisobutyryloxy)ethyl]disulfide,以下简称BiBOEDS)溶液缓慢逐滴加入透析液A中，磁力搅拌反应30-35min，将反应后的混合液转移到透析袋中，采用磷酸缓冲液透析三次，每次透析分别加入终浓度为7.7%、3.85%、1%的二甲亚砜到磷酸缓冲液中，透析结束后，用0.22 μm的过滤器过滤透析袋内的液体，得到透析液B；

3）取5 mL透析液B移入圆底烧瓶A中并连接氮气除氧装置除氧至少23min；