[发明专利]一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒。本发明同时针对β17(A→T)以及β41‑42(‑TCTT)定点修复，通过一次基因编辑即可修复HBB基因两个常见的突变位点，拓展了地中海贫血症和镰刀型贫血症的治疗方法；另外，本发明直接在造血干细胞(HSC)中进行编辑，与现有技术中对iPS细胞进行基因编辑相比，避免了细胞致癌和突变的安全风险，临床使用更为安全。

技术领域

本发明涉及一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒。

背景技术

我国是地中海贫血高发的国家，病例主要分布于广东、广西、海南、贵州、云南、四川、重庆、福建、湖南、湖北、江西等地。其中南方为地中海贫血症的高发地，而广东和广西两省地贫基因缺陷率分别高达10％和20％，病例数占全国总数的2/5以上，已经成为社会性的公共卫生问题。并且由于多省尚未将地中海贫血筛查纳入孕检常规项目，而且近年取消了强制性婚检制度，加上部分地区基层医务人员对该病认知水平不高，导致近年地贫患儿出生率有上升趋势。地中海贫血是一种珠蛋白基因缺陷而引起的遗传性慢性贫血，分为α、β、δβ和δ4种类型，以β和α较为常见。其中β地中海贫血基因突变类型目前已发现至少有186种，主要为β珠蛋白基因(HBB1)上的点突变。我国常见的突变型有6种：①β41-42(-TCTT)，约占45％；②IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24％；③β17(A→T)，约占14％；④TATA盒-28(A→T)，约占9％；⑤β71-72(+A)，约占2％；⑥β26(G→A)，即HbE26，约占2％。

镰刀型贫血症是另外一种全球高发的血红蛋白病，临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛以致慢性局部缺血导致器官组织损害，甚至死亡。该病主要见于非洲黑人(基因携带率约20％)，也见于中东、希腊、意大利等地中海沿岸国家，以及印度、印第安人等，我国南方也有发现病例，发病范围分布很广。镰刀型贫血症为常染色体隐性遗传性疾病。患者血红蛋白β-肽链(由HBB1基因编码)第6位氨基酸由谷氨酸突变成缬氨酸，形成的镰状血红蛋白HbS取代了正常HbA，在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞镰变。

地中海贫血和镰刀型贫血患者主要通过规范性长期输血和去铁治疗来缓解病症，但这种方式不但不能治愈，也带来较高的临床安全隐患。造血干细胞移植是目前唯一能根治地中海贫血和镰刀型贫血的治疗技术，多以骨髓造血干细胞和脐血干细胞异体移植为主。骨髓配型是限制干细胞异体移植的关键问题，即使配型成功还是有产生免疫排斥的风险，在临床上难以大范围应用。虽然理论上脐血配型相较骨髓更加简单，同胞脐血移植能够彻底治愈重型地中海贫血和镰刀型贫血症，非同胞的异体脐血干细胞移植配型成功的几率也相对较大，但在我国公共脐血库不完善的环境下，要在临床上大规模推广仍然非常困难。

自体造血干细胞移植可以解决上述配型和免疫排斥问题，但患者自身的造血干细胞也同样存在基因缺陷，无法直接用于治疗。然而，在体外通过基因编辑手段修复自体干细胞的基因突变缺陷，再将基因修复后的干细胞移植回患者体内，一方面可以修复基因缺陷，重塑患者造血系统，另一方面避免了免疫排斥风险，是最直接有效的治疗方式，是目前地中海贫血和镰刀型贫血临床治疗研究的前沿和热点，目前尚处于临床前研究阶段。