[发明专利]一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法

说明书

本发明公开了一种提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法，属于生物技术领域。本发明通过对多个ms1雄性不育突变体的不育度分析和对小麦Ms1同源基因Ms‑A1和Ms‑D1的表达分析，发现小麦育性基因Ms1的同源基因Ms‑A1和Ms‑D1的低量表达可导致植株不育度降低。本发明利用CRISPR/Cas9技术对ms1突变体中Ms‑A1和Ms‑D1基因进行定点突变，获得了Ms1、Ms‑A1和Ms‑D1基因的三重突变体，且突变体的不育度达到了100%，对于建立高效的小麦杂交种制种技术和杂种优势具有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及一种通过突变提高小麦ms1雄性不育系纯度的方法。

背景技术

杂种优势是生物界的普遍现象，杂交种育种是选育新品种的主要途径，是近代育种工作最重要方法。小麦是自花授粉作物，小麦杂种优势利用的核心问题是高效生产小麦杂交种的技术体系。综合近50年来的研究进展，小麦杂种优势利用研究主要集中于：核质互作雄性不育的利用(“三系法”)、化学杀雄技术的利用(“化杀法”)和光温敏核雄性不育的利用(“两系法”)。三系法由于不育系难以繁殖、恢复源较窄、细胞质副效应等原因，未能在生产上大面积应用。化杀法避开了恢复与保持间的相互关系，但由于其在制种过程中稳定性差、制种成本高及环境污染等多方面原因，在实际生产上也难以推广利用。基于光温敏的两系法虽然具有制种成本低、恢复源广泛，较易获得优势组合等优点，但也面临着两大关键问题——环境因素的不稳定性对不育系育性的影响和利用光温敏特性所选育的小麦不育系十分有限。

隐性核雄性不育突变体用于作物杂种优势利用，其不育性具有易被恢复而不易被保持的特性。与细胞质雄性不育杂交小麦体系相比，隐性核雄性不育突变体具有不受外源细胞质的负面影响、父本系对杂种F₁的育性恢复度高、选材范围广、种质资源利用率高等优点。但与细胞质雄性不育突变体和光温敏雄性不育突变体一样，隐性核雄性不育突变体用于杂交制种时，突变体的雄性不育度直接影响杂交种的纯度，进而影响杂交小麦的产量。突变体的雄性不育度越高，杂交种的纯度越高。

本发明在不同时间地点对多个ms1雄性不育突变体的不育度进行了调查，结果不育度都不到100％，且不同时间地点的不育度差异较大，这将对杂交制种技术开发造成不利影响。分析其原因可能是与Ms1基因高度同源且具有相同功能的Ms-A1基因和Ms-D1基因的低量表达所致，因此，稳定突变Ms-A1基因和Ms-D1基因是必须的。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒，致使目的基因功能的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效，是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编辑新技术。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(doublestrand break,DSB)，细胞可通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)进行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究等领域得到广泛的应用。