[发明专利]一种凝血酶的检测方法

权利要求书

1.一种凝血酶检测方法，包括如下步骤：

(1)核酸分子发夹结构溶液的制备：将适体1制备形成核酸分子发夹结构，其中，适体1序列为5’-GGTTGGTGTGGTTGGCCCCCCTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTCAAAAAC-3’；

(2)邻位连接技术诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构：将适量待测凝血酶溶液加入到适量步骤(1)所得溶液和适量适体2的混合溶液中，进行PLA诱导发夹转换为DNA酶结构反应，其中，适体2序列为5’-GAGAAATGGTCTGTCACACCCCCCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；

(3)DNA酶结构的剪切：将步骤(2)所得溶液与10mM MgCl ₂一起温育30分钟，进行剪切反应；

(4)熵驱动的放大反应：将适量步骤(3)反应所得溶液加入到50nM DNA复合物与50nM燃料链序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应，其中，DNA复合物由序列R，序列S和序列Q杂交后得到，

序列R:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCGCATTTCTC-3’，

序列S:5’-FAM-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’，FAM代表羧基荧光素，序列Q:5’-GTTTTTGAGAAATGCGAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG-Dabcyl-3’，Dabcyl代表猝灭剂4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸，

燃料链序列F:5’-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTCGCATTTCTC-3’；

(5)荧光光谱检测，用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的荧光光谱；

(6)计算凝血酶浓度，用标准曲线法，通过荧光强度计算凝血酶浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测凝血酶溶液为Tris-HCl稀释的人血清。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)具体为：将含有0.1M NaCl的25mM pH值为7.5的Tris-HCl溶液中的适体1加热至95℃并保持5分钟，然后将其冷却至室温至少2小时以形成发夹结构。

4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于步骤(2)具体为：将10μL待测凝血酶溶液加入到50nM步骤(1)所得溶液和50nM适体2的25mM Tris-HCl溶液中，用0.1M NaCl在pH值为7.5，37℃下进行5小时PLA诱导的核酸分子发夹至DNA酶结构转换反应。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)具体为：将适量步骤(2)反应所得溶液加入到具有5mM MgCl₂和0.1M NaCl的25mM pH值为8.0的Tris-HCl缓冲溶液的50nM DNA复合物和50nM序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(5)具体为：用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的500nm至600nm荧光光谱。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(6)中荧光强度是指520nm处的荧光强度。