[发明专利]一种凝血酶的检测方法

说明书

本发明涉及一种凝血酶检测方法。其基于邻位连接技术，即“proximity ligation assay”，简称PLA，诱导核酸分子发夹转换成DNA酶，即DNAzyme结构，进行熵驱动放大检测。在存在凝血酶的情况下，PLA可以诱导发夹的解锁，然后形成活性DNA酶。随后，DNA酶可以剪切底物链S‑DNA并诱导熵驱动的放大反应，通过将猝灭剂分子与羧基荧光素FAM分离，显著恢复荧光强度。荧光强度和凝血酶浓度之间存在良好的线性关系，范围为5pM至1nM，检测限度计算为1pM，提供了高可靠性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及凝血酶的检测领域，特别是无酶信号放大的凝血酶检测技术。

背景技术

凝血酶是通过凝血酶原的蛋白水解活化产生的丝氨酸蛋白酶。它可以将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链，以及催化许多其他凝血相关反应。由于激素样特性，凝血酶参与血栓形成和血小板活化过程。此外，凝血酶被用作诊断肺转移的肿瘤标志物。血液中皮摩尔范围的凝血酶检测在相关疾病的临床诊断中具有重要意义。

适体是通过称为“通过指数富集(SELEX)配体的系统进化”的特定过程分离的单链寡核苷酸。适体的目标显示出很大的多样性，例如小分子，肽，蛋白质，甚至细胞。适体可以很容易地进行化学合成和修饰，这使其成为生物传感器设计的一种有前景的识别探针。已经开发了各种基于适体的分析技术用于凝血酶检测，包括比色法，荧光，电化学和表面增强拉曼散射。

PLA(邻位连接技术，即“proximity ligation assay”，简称PLA)是Fredriksson(Fredriksson S,Gullberg M,Jarvius J,et al.Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.[J].Nature Biotechnology,2002,20(5):473-477.)提出的一种高效的蛋白质分析方法。PLA的机制基于通过具有高亲和力的一对探针同时识别蛋白质，导致表面探针的局部浓度增加。探针的高局部浓度提供了相邻DNA序列的高杂交效率。最近，PLA策略在蛋白质组学，代谢组学，生物传感和单细胞成像方面展示了巨大的潜力。此外，通过各种无酶放大策略显着提高了PLA的灵敏度(Koos B,O.Designingand Applying Proximity‐Dependent Hybridization Chain Reaction[M]//CurrentProtocols in Protein Science.John WileySons,Inc.2016:19.28.1.)。然而，这些由碱基自由能驱动的典型放大策略可能导致相对高的背景和假阳性结果。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种PLA(邻位连接技术，即“proximity ligationassay”，简称PLA)诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构的熵驱动的放大反应，用于凝血酶的检测。

本发明的检测原理为：当不存在凝血酶时，DNA酶的酶链(E-DNA)和底物链(S-DNA)通过分子内杂交锁定在核酸分子发夹结构中，同时抑制了DNA酶的催化活性。在存在凝血酶的情况下，PLA反应导致核酸分子发夹的解锁，形成具有活性DNA酶。DNA酶的催化核心可以在Mg²⁺的辅助下，将S-DNA在rA位点处裂解。被剪切的DNA部分稳定变差，然后离开DNA酶结构。随后，它可以诱导熵驱动信号放大反应，通过将猝灭剂分子与羧基荧光素(FAM)分离，使得荧光强度显著恢复。